Antikörper-Microarray: Eine Technik zur Untersuchung der Proteinexpression von miRNA-behandelten Lungenkrebszellen

- Beginnen Sie mit der Zugabe einer Biotinlösung und eines Markierungspuffers zur Proteinprobe. Inkubieren, um die Bindung von Biotin an die Proteine zu erleichtern. Fügen Sie ein Stoppreagenz und einen Vortex hinzu. Legen Sie anschließend einen Antikörper-Microarray-Objektträger in eine Schale, die ein Blockierungsreagenz enthält, um eine unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. Waschen Sie den Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser, um die Verstopfungslösung zu entfernen. Legen Sie den Microarray-Objektträger in eine Kammer. Mischen Sie die biotinylierte Proteinprobe mit einer Kupplungslösung und geben Sie sie auf den Objektträger, um die Bindung der Zielproteine an die entsprechenden Antikörper zu erleichtern. Schieben Sie den Objektträger in eine Schüssel mit einem Waschpuffer und ersetzen Sie den Puffer durch doppelt destilliertes Wasser. Legen Sie den Objektträger anschließend in einen Detektionspuffer, der fluoreszenzmarkiertes Streptavidin enthält, um seine Bindung an die biotinylierten Proteine zu fördern.

Inkubieren Sie die Schale im Dunkeln, um die Fluoreszenzintensität aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie den Objektträger und legen Sie ihn in einen Microarray-Scanner. Der Scanner sucht nach fluoreszierenden Signalen vom Streptavidin, das an das Zielprotein gebunden ist. Basierend auf der Fluoreszenzintensität analysiert die Software das Ausmaß der Proteinexpression. Im folgenden Protokoll führen wir einen Antikörper-Microarray zur Analyse von Veränderungen in der Genexpression durch, die mit dem Zellzyklus verbunden sind.

- Dieses Experiment dient dazu, die Expressionsänderung aller Proteine des Zellzykluswegs durch die microRNA-Behandlung zu identifizieren. Entnahme von Proteinproben gemäß dem im Abschnitt Transfektion beschriebenen Verfahren und Quantifizierung mit BCA-Assay. Entfernen Sie die Objektträger eine Stunde vor dem Experiment bei minus 4 Grad Celsius, um sie auf Raumtemperatur zu bringen und Feuchtigkeit zu entfernen. Entnehmen Sie 70 Mikrogramm Proteinproben und bereiten Sie Probenträger nach Herstellerangaben vor, die ebenfalls Schritt für Schritt im Textteil beschrieben sind.

Hier ist zu beachten, dass das richtige Waschen der Objektträger mit hochreinem deionisiertem Wasser ein weiterer wichtiger Schritt ist, da dies dazu beiträgt, den Hintergrund der Objektträger zu reduzieren. Darüber hinaus ist es bei diesem Experiment sehr wichtig, die Objektträger bis zum letzten Schritt nicht auszutrocknen. Scannen Sie abschließend den Objektträger mit einem Microarray-Gerät und analysieren Sie die Daten.