miRNA-Extraktion: Eine Methode zur Extraktion von miRNA aus Plasmaproben

- MicroRNAs oder miRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die an der Genregulation beteiligt sind. Ihre Expression wird während einer Krebserkrankung verändert und ist daher ein potenzieller Biomarker für Krebs. Um mit der miRNA-Isolierung zu beginnen, nehmen Sie eine frisch entnommene Vollblutprobe und zentrifugieren Sie sie bei 4 Grad Celsius, um das Plasma von den Blutzellen zu trennen. Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen und erneut zentrifugieren, um einen klareren Plasmaüberstand zu erhalten. Der Überstand wird extrahiert, mit gekühlter Homogenisierungslösung behandelt, gefolgt von einem Lysepuffer zur Homogenisierung der Probe. Fügen Sie Proteinase-K-Enzymlösung hinzu, um Proteine abzubauen, insbesondere die Nukleasen, die sonst RNA in nachgelagerten Schritten verdauen würden.

- Laden Sie anschließend das Lysat in die dafür vorgesehene Vertiefung einer vormontierten instrumentenspezifischen Nukleinsäure-Extraktionspatrone. Geben Sie DNase 1-Lösung in die entsprechende Vertiefung, um genomische DNA aus der Probe zu entfernen. Geben Sie nukleasefreies Wasser in das auf der Kartusche montierte Elutionsröhrchen, um es vor der miRNA-Isolierung zu konditionieren. Legen Sie die Kartuschenbaugruppe in den Nukleinsäureextraktor ein. Wählen Sie die geeignete miRNA-Aufreinigungssoftware aus und führen Sie sie aus. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie das Elutionsröhrchen mit der miRNA und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.

- Im folgenden Protokoll zeigen wir die miRNA-Extraktion aus Blutproben von Patienten für die Lungenkrebsvorsorge.

- Um dieses Protokoll zu starten, verwenden Sie Vacutainer-Röhrchen, um 10 Milliliter Vollblutprobe zu entnehmen. Bei Raumtemperatur lagern.

- Lagern Sie Vollblut nicht bei niedrigen Temperaturen, wie z. B. 4 Grad Celsius, um Temperaturschocks und Zelllyse zu vermeiden, die zu einer unspezifischen microRNA-Freisetzung führen.

- Zentrifugieren Sie das Plasma innerhalb einer Stunde, um es zu trennen. Achten Sie darauf, den Kontakt mit dem Lymphring zu vermeiden, und geben Sie den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird der Überstand unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Aliquotieren Sie 1 Milliliter dieses Plasmaüberstands in 1,5-Millimeter-Kryoröhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die Plasmafraktion nicht vom Röhrchenboden sammelt. Um mit der RNA-Isolierung zu beginnen, fügen Sie 200 Mikroliter vorgekühlte OMG-Lösung zu 200 Mikrolitern Plasma für jede Probe hinzu. Um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten, 15 bis 30 Sekunden lang vortexen. Um die Probe zu homogenisieren, fügen Sie 200 Mikroliter Lysepuffer und 25 Mikroliter Proteinase K pro Probe hinzu und wirbeln Sie sie 20 Sekunden lang ein.

- Anschließend werden die Proben bei 37 Grad Celsius in einem Thermomixer 15 Minuten lang inkubiert. Wählen Sie als Nächstes die RSC miRNA-Gewebemethode und laden Sie eine Kartusche für jede Probe auf eine Deckschale eines automatischen Nukleinsäureextraktors, wobei Sie den Kolben richtig platzieren. Übertragen Sie das Lysat und fügen Sie 5 Mikroliter DNase 1-Lösung an die entsprechenden Positionen in der Instrumentenkartusche hinzu. Geben Sie an den Boden jedes Elutionsröhrchens 60 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Um die automatische Reinigung zu starten, starten Sie den Lauf. Lagern Sie die gesamten RNA-Proben bei minus 80 Grad Celsius.