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- Legen Sie zunächst einen dünnen Gewebeschnitt in eine Ammoniaklösung, um eine schonende Antigenentnahme zu ermöglichen. Übertragen Sie den Schnitt auf einen mit Polylysin beschichteten Objektträger. Negativ geladene Zellen binden an das positiv geladene Polylysin. Fügen Sie anschließend Wasserstoffperoxid hinzu, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie den Objektträger in Tris-Buffered Kochsalzlösung, TBS.
TBS fördert den Zugang der Antikörper zu Antigenen, indem es die Proteinvernetzungen aufbricht. Waschen Sie den Schnitt mit einer Blocklösung, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Geben Sie primäre Antikörper in den Schnitt und inkubieren Sie über Nacht. Der primäre Antikörper bindet an sein spezifisches Antigen, das auf der Zelloberfläche vorhanden ist. Waschen Sie den Objektträger mit TBS.
Fügen Sie Biotin-konjugierte Sekundärantikörper hinzu, die an die Fc-Region des Primärantikörpers binden. Waschen Sie den Abschnitt mit dem Enzym Streptavidin-Biotin-Peroxidase. Als nächstes fügen Sie dem Gewebe ein chromogenes Substrat der Peroxidase hinzu. Die Peroxidase wandelt Chromogen in ein gefärbtes unlösliches Produkt um.
Färben Sie das Gewebe mit Hämatoxylinlösung. Hämatoxylin bindet an die sauren Bestandteile der Zellen und färbt sie blau. Beobachten Sie das Gewebe unter einem Lichtmikroskop. Die Antigene werden als rot detektiert, während die Zellen aufgrund von Hämatoxylin blau erscheinen. Im folgenden Protokoll werden wir immunhistochemische Färbungen durchführen, um CD45- und CD1a-Zellen aus endobronchialen Biopsien zu identifizieren.
- Stellen Sie vor dem Schneiden des eingebetteten Biopsiegewebes den Messerhalter vorsichtig in den Winkel des Biopsieblocks ein, sodass die Klinge flach auf der Oberfläche des Blocks aufliegt. Schneiden Sie dann langsam mindestens zwei 2 Mikrometer dicke Abschnitte von jeder endobronchialen Biopsieprobe ab und übertragen Sie jede frisch geschnittene Gewebescheibe mit einer Pinzette in eine 0,05%ige Lösung aus Ammoniak und destilliertem Wasser. Verwenden Sie nach 45 bis 90 Sekunden einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um jeden entfalteten Schnitt aufzunehmen und lassen Sie die Schnitte mindestens eine Stunde lang trocknen.
Wenn die Schnitte getrocknet sind, beschriften Sie die Objektträger entsprechend dem Experiment und ziehen Sie eine hydrophobe Barriere um jede Probe. Tragen Sie anschließend 1 Milliliter frisch zubereitete Peroxidase-Blocklösung auf die Schnitte auf. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Peroxidase-Blocklösung und waschen Sie die Schnitte dann dreimal fünf Minuten lang mit TBS, entfernen Sie dann das TBS und fügen Sie eine 1%ige BSA-Blockierungslösung für eine weitere 30-minütige Inkubation hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.
Am Ende der Inkubation fügen Sie den primären Antikörper von Interesse, verdünnt in TBS, hinzu und decken Sie die Proben für eine Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur ab. Waschen Sie die Objektträger am nächsten Morgen dreimal in TBS und tragen Sie den gewünschten Sekundärantikörper zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Objektträger noch dreimal in frischem TBS und inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplexlösung, gefolgt von drei weiteren TBS-Wäschen.
Behandeln Sie die Gerichte dann 20 bis 30 Minuten lang mit frisch zubereiteter AEC-Peroxidase-Substratlösung. Wenn sich die gewünschte Fleckenintensität entwickelt hat, spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang unter fließendem Leitungswasser ab und färben Sie die Abschnitte mit gefilterter Mayer-Hämatoxylin-Lösung gegen. Nach zwei Minuten waschen Sie die Objektträger weitere fünf Minuten lang unter fließendem Leitungswasser, lassen Sie die Objektträger abtropfen und bedecken Sie die Abschnitte mit permanentem wässrigem Einbettmedium, während Sie die Proben in einem 80 Grad Celsius heißen Trockenofen trocknen.
Nach dem Abkühlen montieren Sie die Proben mit DPX-Eindeckmedium und einem Deckglas für ihre Analyse in 40-facher Vergrößerung am Lichtmikroskop.