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Krebsforschung
0 Aufrufe • 5:08 Min. • April 30th, 2023
- Die photodynamische Therapie oder PDT ist eine Art der Lichttherapie, bei der Photosensibilisatoren verwendet werden - Moleküle, die durch Licht bestimmter Wellenlängen aktiviert werden. Ein angeregter Photosensibilisator wandelt den in den Zellen vorhandenen molekularen Sauerstoff in reaktive Sauerstoffspezies um, die den Zelltod verursachen. Um den Assay zu beginnen, bereiten Sie ein gewünschtes Nanopartikel-basiertes Wirkstoffabgabesystem vor, das die entsprechende Konzentration des Photosensibilisators trägt, allein oder in Kombination mit einem Testmedikament.
Geben Sie die bevorzugte Konzentration dieser Nanopartikelsuspension in eine Kultur von Lungenkrebszellen. Inkubieren Sie die Kultur für eine angemessene Zeit im Dunkeln, um die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln zu erleichtern. Ersetzen Sie die Suspension durch das gewünschte Nährmedium. Positionieren Sie anschließend einen Faserlaser für die photodynamische Therapie in optimalem Abstand über der Kultur, um eine gleichmäßige Beleuchtung zu ermöglichen. Bestrahlen Sie die Zellen für die gewünschte Zeit bei einer geeigneten Wellenlänge und inkubieren Sie über Nacht.
Ersetzen Sie das Medium durch eine geeignete Zytotoxizitätsmesslösung. Verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen und die zytotoxischen Wirkungen der experimentellen Behandlung zu quantifizieren. Bestrahlte Zellen, die den Photosensibilisator enthalten, zeigen eine verminderte Lebensfähigkeit. Im folgenden Protokoll werden wir eine in vitro Phototoxizitätsanalyse von Hypocrellin B, einem Photosensibilisator, und Paclitaxel, einem Krebsmedikament, durchführen, die in Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikeln in A549-Lungenkrebszellen verkapselt sind.
- Synthetisieren Sie zunächst Hyaluronsäure-Ceramid, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Reinigen Sie das Produkt mit einer 3,5-Kilodalton-Dialysemembran und lyophilisieren Sie es.
Als nächstes bereiten Sie Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel selbst vor, Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel zusammen mit dem Photosensibilisator und Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel mit einem Antikrebsmittel und dem Photosensibilisator.
Die Lungenkrebszelllinie A549 wird in die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte mit einer Dichte von 1 mal 10 bis fünf Zellen pro Vertiefung ausgesät und die Zellen 24 Stunden lang inkubiert. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium und waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS.
Dann lösen Sie die vorbereiteten Nanopartikel in PBS durch Vortexen auf eine Endkonzentration von 2 Mikromol pro Milliliter des Photosensibilisators Hypocrellin B auf.
Geben Sie in jeweils vier Vertiefungen 1 Milliliter PBS, 1 Milliliter der leeren Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel, 1 Milliliter der Nanopartikel, die den Photosensibilisator enthalten, und 1 Milliliter der Nanopartikel, die sowohl den Photosensibilisator als auch das Krebsmedikament enthalten.
Wenn Sie fertig sind, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln, damit die Nanopartikel in die Zellen gelangen können. Entfernen Sie dann alle Lösungen und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 Milliliter kaltes PBS hinzufügen.
Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal und fügen Sie dann frisches Nährmedium hinzu. Legen Sie als Nächstes die 24-Well-Kulturplatte unter eine photodynamische Therapiefaser und positionieren Sie die Faser 1 Zentimeter von der ersten Vertiefung entfernt.
- Der Abstand von der Faser der photodynamischen Therapie zu den Zellen war der entscheidende Faktor in dieser Studie. Es war wichtig, den optimalen Abstand herauszufinden, der die gesamte Zelle mit dem Licht abdecken kann.
- Setzen Sie dann eine Schutzbrille auf und schalten Sie das Licht aus. Beleuchten Sie die Zellen mit dem Laser im Dunkeln für 5 bis 40 Sekunden, um hochreaktiven Singulett-Sauerstoff und andere freie Radikale in den Photosensibilisator-haltigen Nanopartikeln zu aktivieren.
Nach der Lichteinwirkung die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln inkubieren. Als nächstes aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen die Zellen mit 1 Milliliter kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal und geben Sie dann 100 Mikroliter Medium und 10 Mikroliter Zytotoxizitätsmesslösung in jede Vertiefung
.Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang im Dunkeln in der Lösung und geben Sie dann alle Proben auf eine 96-Well-Platte. Messen Sie die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader.