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- Exosomen sind kleine, membrangebundene Vesikel, die Biomoleküle wie Lipide, Proteine, DNA, mRNA und microRNA tragen. Exosomen werden von verschiedenen Zelltypen in extrazelluläre Räume abgegeben und können aus Bioflüssigkeiten wie Plasma isoliert werden.
Zentrifugieren Sie zunächst die Plasmaprobe, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Den Plasmaüberstand in ein frisches Röhrchen überführen. Behandeln Sie das Plasma mit der gewünschten Konzentration des Ribonuklease-Enzyms. Inkubieren Sie die Probe auf einem Heizblock bei 37 Grad Celsius für eine angemessene Dauer.
Das Enzym baut jegliche freie RNA in der Probe ab, während die exosomale RNA geschützt bleibt. Verdünnen Sie die Probe mit PBS. Fügen Sie anschließend die gewünschte Konzentration der Proteinase-K-Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie sie für eine angemessene Zeit bei 37 Grad Celsius. Proteinase K baut den Großteil der Plasmaproteine ab. Es inaktiviert auch das zuvor hinzugefügte Ribonuklease-Enzym, wodurch das Risiko eines exosomalen RNA-Abbaus während der nachgelagerten Verarbeitung eliminiert wird.
Fügen Sie ein geeignetes Volumen Exosom-Fällungspuffer hinzu, um die Trennung des Exosoms vom Plasma zu erleichtern. Zentrifugieren Sie die Probe, um ein Pellet mit intakten Exosomen zu erhalten. Die isolierten Exosomen finden Anwendung in nachgelagerten Schritten wie RNA- und Proteinextraktionen.
Im folgenden Protokoll führen wir eine Exosomenisolierung aus der Plasmaprobe von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs durch.
- Tauen Sie zunächst eine 1-Milliliter-Plasmaprobe auf Eis auf. Nach dem Auftauen das Röhrchen mehrmals umdrehen, um eventuell gebildete Kryopräzipitate zu disaggregieren. Zentrifugieren Sie dann das Plasma 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.000 g, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie das Plasma erneut, jetzt bei 10.000 G für 20 Minuten. Sammeln Sie auch hier den Plasmaüberstand und fügen Sie nun 10 Mikroliter RNAse hinzu. Inkubieren Sie das Plasma bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten in einer thermischen Blockheizung.
- Wir haben dem Standard-Kit-Protokoll einen RNAse-Behandlungsschritt hinzugefügt, um die freien microRNAs abzubauen. Später wurde der im Kit-Protokoll enthaltene Proteinase-K-Behandlungsschritt genutzt, um die RNAse abzubauen und die Integrität exosomaler microRNAs zu schützen.
- Als nächstes überträgst du das Plasma in ein neues Röhrchen mit einem halben Volumen von 1x PBS und wirbelst es. Fügen Sie dann 0,05 Volumen Proteinase-K-Lösung hinzu, wirbeln Sie die Probe erneut vor und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nun 0,2 Volumina Exosomen-Fällungspuffer hinzu und mischen Sie die Probe durch Inversion. Inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nach der Kaltinkubation zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 10.000 g bei Raumtemperatur. Entnehmen Sie ein Aliquot von 20 bis 50 Mikrolitern des Überstands und lagern Sie es zu Kontrollzwecken. Aspirieren Sie dann den restlichen Überstand und verwerfen Sie ihn.
Resuspendieren Sie das Exosom-Pellet in einem Puffer Ihrer Wahl in einem Volumen, das von der nachgeschalteten Analyse abhängt. Für die RNA-Analyse fügen Sie einen spezifischen Lysepuffer für die RNA-Extraktion hinzu.