Lungeninstillation und -fixierung: Einbringen von Flüssigkeit in die Luftröhre und Fixieren der Lunge zur Messung des fixierten Lungenvolumens

- Die Lungeninstillation wird verwendet, um eine Substanz direkt in die Luftröhre einzuführen, um die Lungen von Mäusen mit Krebs oder anderen Erkrankungen zu analysieren. Platzieren Sie zunächst eine anästhesierte Maus auf einer Intubationsplattform am Hang und rasieren Sie die Haare am Hals. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer Schere unterhalb des Halses und ziehen Sie vorsichtig mit einer Pinzette an der Haut, um die Luftröhre freizulegen. Führen Sie einen Katheter durch den Mund in die Luftröhre ein und beobachten Sie ihn durch einen Schnitt. Injizieren Sie beispielsweise Flüssigkeit in die Luftröhre und blasen Sie die Lunge schnell auf, indem Sie mit einer leeren Spritze Luft einleiten, um die Flüssigkeit richtig zu verteilen.

Schließen Sie die Wunde und legen Sie die Maus in eine Auffangkammer. Nach der gewünschten Zeit die Maus opfern und die Lunge freilegen. Blasen Sie es mit Fixiermittel auf, um die Gesamtkapazität der Lunge zu quantifizieren. Legen Sie die Lunge in einen Schlauch mit einem Fixiermittel. Messen Sie das fixierte Lungenvolumen nach dem Archimedischen Prinzip. Legen Sie die Lunge ins Wasser und drücken Sie sie mit einem kabelgebundenen Gerät. Beachten Sie das Gewicht des Wassers, das von den untergetauchten Lungen verdrängt wird. Der Anteil des Lungenvolumens in der fixierten linken Lunge ist in der Regel kleiner als der in vivo gemessene.

- Biegen Sie vor Beginn des Eingriffs die Spitze einer handelsüblichen 1 Zoll langen intravenösen Kanüle mit 20 Gauge manuell in eine leichte Krümmung. Tragen Sie dann, nachdem Sie die Anästhesie durch mangelndes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen bestätigt haben, Salbe auf die Augen einer erwachsenen Maus auf und fixieren Sie die Maus in Rückenlage auf einer schrägen Plattform mit einem großen Bürobinder und Nahtschlaufen. Rasieren Sie den ventralen Teil des Halses und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Alkohol. Machen Sie dann mit einer scharfen Schere einen kleinen chirurgischen Schnitt im Nacken, etwa 12 Millimeter unterhalb des unteren Schneidezahns.

Ziehen Sie anschließend mit einer Pinzette sanft nach kaudalem Hals, bis die ventrale Wand der Luftröhre zu sehen ist. Ziehen Sie dann die Zunge vorsichtig zurück und führen Sie die Kanüle mit der gebogenen Spitze in Richtung der Bauchfläche der Maus ein. Ziehen Sie erneut sanft an der Halshaut, wie gerade gezeigt, und führen Sie die Kanüle in die Luftröhre ein. Wenn der Katheter in der Luftröhre zu beobachten ist, schieben Sie den Katheter etwa 5 Millimeter vor, um die Stimmbänder zu passieren.

Legen Sie nun die Spitze einer mit 50 Mikrolitern des Instillats beladenen Gelladepipette in die untere Nabe des Katheters. Bestätigen Sie, dass sich die Flüssigkeit in der Spitze synchron mit der Atmung der Maus bewegt, und injizieren Sie dann das Instillat. Blasen Sie die Lunge sofort mit einer 1-Milliliter-Spritze mit 0,6 Millilitern Luft durch den Katheter auf, um die Flüssigkeit tief in der Lunge zu verteilen, und entfernen Sie dann die Kanüle. Verschließen Sie die Operationswunde mit einer kleinen Menge Cyanacrylatkleber und setzen Sie die Maus in einen Einzelkäfig mit Überwachung, bis sie vollständig geborgen ist.

Machen Sie nach dem letzten Versuchszeitpunkt einen kleinen Schnitt in den Hals des Tieres, um die ventrale Seite der Luftröhre freizulegen. Führen Sie dann eine 18-Gauge-Stichnadelspitze in die Luftröhre ein. Binden Sie die Nadel mit einem Faden in die Luftröhre und öffnen Sie den Thorax vorsichtig mit einem Mittellinienschnitt. Schneiden Sie dann das Zwerchfell ab und entfernen Sie die seitlichen Brustwände, um die Lunge freizulegen. Stellen Sie anschließend sicher, dass sich keine Luft in den Befestigungsschlauch befindet, indem Sie Formaldehyd am Ende des Absperrhahns laufen lassen. Verbinden Sie dann das Formalinreservoir und den gefüllten Schlauch direkt mit dem unteren Ende der Trachealnadel.

Setzen Sie die Oberseite des Formaldehyds 25 Zentimeter über die Höhe des Mundes und öffnen Sie den Absperrhahn, um die Lunge mit einem Fixiermittel aufzublasen. Nachdem Sie die Lunge mindestens 20 Minuten lang unter Druck gelassen haben, ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um mehr von der nicht kanülierten Luftröhre freizulegen, während Sie die Luftröhre über das Ende der Stummelnadel hinaus abbinden. Wenn die Luftröhre fest gebunden ist, entfernen Sie den Absperrhahn und präparieren Sie vorsichtig die Lunge. Legen Sie dann die Lunge über Nacht in Formaldehyd.

Hier wird eine typische Vorrichtung zum Halten der Lunge während des festen Lungenvolumens gezeigt, die aus Kunststoffpipetten und dünnem 20-Gauge-Draht besteht. Um das fixierte Lungenvolumen zu messen, präparieren Sie zunächst das Herz und alle anderen Nicht-Lungengewebe aus der Lunge. Stellen Sie dann ein Becherglas mit etwa 200 Millilitern Wasser, das mit einer Drahtstütze ausgestattet ist, auf eine Waage und tarieren Sie das Gerät.

Entfernen Sie dann das Gerät, legen Sie die Lunge auf die Wasseroberfläche und drücken Sie mit dem Gerät das Gewebe unter das Wasser, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Lunge, das Nahtmaterial oder ein anderer Teil des Geräts nicht die Seiten oder den Boden des Becherglases berührt. Notieren Sie das Gewicht auf der Waage. Diese Zahl spiegelt das Volumen des verdrängten Wassers wider und ist somit ein direktes Maß für das Lungenvolumen. Trocknen Sie dann die Lunge auf einem Wischer ab, tarieren Sie den Becher wieder mit dem Gerät und wiederholen Sie die Lungenvolumenmessung. Die beiden Volumenmessungen sollten dann gemittelt werden.