JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 5:29 Min. • April 30th, 2023
- Nehmen Sie einen funktionalisierten Draht, an dessen Oberfläche Zellen befestigt und durch Immunfluoreszenzfärbung gefärbt sind. Waschen Sie es mit einer eiskalten Kochsalzlösung, Natriumcitrat oder SSC-Lösung. Legen Sie den Draht in ein Mikroröhrchen mit fluoreszenzmarkierten Sonden und verschließen Sie es mit einem Drahtstopfen. Inkubieren Sie das Mikroröhrchen in einer dunklen, feuchten Kammer in einem Hybridisierungsofen bei 75 Grad Celsius, um die DNA in den Zellen zu denaturieren.
Bringen Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius in einen Ofen, damit die Sonden an die komplementäre Sequenz auf der DNA binden können. Nehmen Sie dann die Kammer aus dem Ofen und nehmen Sie den Draht heraus. Tauchen Sie den Draht in ein Rohr mit SSC-Lösung bei der gewünschten Temperatur. Waschen Sie den Draht mit der SSC-Lösung, die Tween enthält, um unspezifische oder teilweise hybridisierte Sonden zu entfernen, und waschen Sie ihn erneut in destilliertem Wasser.
Trocknen Sie den Draht und inkubieren Sie die funktionalisierte Spitze in DAPI-Lösung, um die Zellkerne zu färben. Spülen Sie den Draht in PBS ab und trocknen Sie ihn an der Luft. Legen Sie den Draht unter ein Fluoreszenzmikroskop. Die Sonde, die mit dem interessierenden Gen hybridisiert ist, erscheint als fluoreszierender Fleck in den Zellkernen. Im folgenden Protokoll werden wir 3D-DNA-FISH durchführen, um die Translokation des ALK-Gens in Lungenkrebszellen zu bestimmen.
- Stellen Sie den Hybridisierungsofen 3 Stunden vor dem DNA-FISH-Protokoll auf 75 Grad Celsius und den Trockenheizofen auf 37 Grad Celsius ein. Kühlen Sie die 0,4-fache SSC-Lösung auf 4 Grad Celsius ab. Waschen Sie den Draht dreimal in eiskalter 0,4-facher SSC-Lösung. Trocknen Sie den Draht 10 Minuten lang im Dunkeln unter dem Abzugsschrank
.Nach 10 Minuten die Sonde 5 Sekunden lang wirbeln und drehen. Lassen Sie 10 Mikroliter der Sonde in Mikroröhrchen aus Glas fallen und decken Sie diese dann mit Laborfolie ab. Wickeln Sie die Mikroröhrchen in trockenes, saugfähiges Papier ein, legen Sie sie in eine 50-Milliliter-Tube und drehen Sie sie kurz. Legen Sie den getrockneten Draht vorsichtig in das Mikroröhrchen und setzen Sie den Drahtstopfen ein. Versiegeln Sie dann den Drahtstopper mit Gummizement.
Legen Sie den Draht für 8 Minuten bei 75 Grad Celsius in eine dunkle, feuchte Kammer im Hybridisierungsofen, um eine vollständige DNA-Denaturierung zu erhalten. Nach 8 Minuten stellen Sie die Feuchtkammer über Nacht in einen trockenen Backofen bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie einen Objektträger-Färbebehälter mit 0,4-facher SSC-Lösung in ein auf 72 Grad Celsius eingestelltes Wasserbad. Überprüfen Sie die 0,4-fache SSC-Lösungstemperatur, bis sie 72 plus oder minus 1 Grad Celsius erreicht.
Bereiten Sie als Nächstes zwei Bechergläser vor - eines mit zweifachem SSC plus 0,05%iger Tween-Lösung und das zweite mit destilliertem Wasser. Nehmen Sie die Feuchtkammer aus dem Ofen mit trockener Hitze. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig den Gummizement vom Drahtstopper und ziehen Sie das unbeschichtete Ende des Drahtes durch den Endstopper, wobei Sie darauf achten müssen, die funktionsfähige Spitze nicht zu beschädigen.
Tauchen Sie den Draht 2 Minuten lang bei 72 Grad Celsius in die 0,4-fache SSC-Lösung. Waschen Sie den Draht in zweifachem SSC plus 0,05%iger Tween-Lösung für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann den Draht in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Trocknen Sie den Draht unter dem Abzug 10 Minuten lang im Dunkeln. Inkubieren Sie die funktionalisierte Spitze des Drahtes mit zuvor vorbereiteter DAPI-Lösung in einem 2-Milliliter-Fläschchen. Spülen Sie den Draht zweimal in 1-fach PBS und trocknen Sie den Draht an der Luft.
Positionieren Sie den Draht in den Drahthalter und führen Sie die funktionalisierte Spitze vorsichtig durch den Eintrittspunkt des speziellen Halters, bis die Spitze mit dem Kupplungspunkt übereinstimmt. Setzen Sie die spezielle Halterung auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops mit einer 20-fach-Linse ein. Fokussieren Sie sich zunächst grob auf die spezielle Unterstützung und passen Sie dann die Zellen fein an, die im DAPI-Kanal hell erscheinen.