G-10-säulenbasierte Sortierung von Leukämiezellen: Eine Methode zur Aufreinigung von akuten lymphatischen Leukämiezellen aus Stromazellen des Knochenmarks

- Fügen Sie zunächst Trypsin zu einer Platte hinzu, die Leukämiezellen enthält, die zur Zelldissoziation mit Knochenmarkstromazellen kokultiviert wurden. Zentrifugieren Sie das Pellet und suspendieren Sie es mit vorgewärmten Medien, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Die G-10-Säule enthält vernetzte Dextrankügelchen, die in Wasser aufquellen und eine Gelmatrix bilden.

Äquilibrieren Sie die G-10-Säule mit vorgewärmten Medien, um den Raum zwischen den Perlen zu füllen und ein langsames Austreten des Mediums aus der Säule zu gewährleisten. Halten Sie eine geeignete Temperatur in der Säule aufrecht, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Laden Sie die Zellmischung langsam auf die Gelkügelchen in der G-10-Säule. Inkubieren Sie die Zellen auf der G-10-Säule bei Raumtemperatur für die gewünschte Dauer. Basierend auf den Eigenschaften und der Größe der Zelloberfläche schränken die Gelkügelchen bevorzugt die größeren Stromazellen des Knochenmarks ein und ermöglichen so die Trennung der Leukämiezellen.

Geben Sie vorgewärmtes Medium in die Säule und sammeln Sie die Suspension der Leukämiezellen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Puffer. Verwenden Sie die reine Population von Leukämiezellen für die weitere Analyse. Im folgenden Beispiel trennen wir eine reine Population von Leukämiezellen aus der stromalen Cokultur mit Hilfe der G-10-Säule.

- Wenn der Absperrhahn für jede Subpopulation vollständig geschlossen ist, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um das gesamte 1-Milliliter-Volumen der Zellen tropfenweise auf eine der vorbereiteten G-10-Säulen zu geben, wobei Sie darauf achten, dass die Zellen auf oder innerhalb des G-10-Pellets bleiben. Lassen Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem G-10-Pellet inkubieren. Geben Sie dann 1 bis 3 Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium in die Säule und öffnen Sie den Absperrhahn, so dass das Medium die Säulen langsam tropfenweise verlässt.

Fügen Sie den Säulen weiterhin vorgewärmtes Medium in Schritten von 1 bis 2 Millilitern hinzu. Wenn insgesamt 15 bis 20 Milliliter leukämische Zellen entnommen wurden, schließen Sie den Absperrhahn und verschließen Sie das Entnahmeröhrchen. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder in den entsprechenden nachgeschalteten Analysepuffer

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