T-Zell-Anreicherung: Eine Technik zur Isolierung von T-Zellen aus gemischten Zellpopulationen durch magnetische Trennung
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:57 Min. • April 30th, 2023
- T-Zellen, eine Klasse von Lymphozyten, spielen eine aktive Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen. Neben vielen anderen Blutzelltypen sind immunkompetente T-Zellen in der Milz und den Lymphknoten der Maus vorhanden. Um T-Zellen selektiv zu isolieren, werden Milz und Lymphknoten der Maus entnommen und auf einem Zellsieb mazeriert. Spülen Sie das Gewebe mit einem geeigneten Medium, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Fügen Sie Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK-Puffer hinzu, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Zentrifuge, um die intakten Blutzellen vom Lysat zu trennen. Den Überstand verwerfen und die Zellen in einem geeigneten Puffer resuspendieren. Behandeln Sie die Suspension mit einer Mischung aus biotinylierten Antimaus-Antikörpern, die auf Blutzellen wie Granulozyten, B-Zellen, NK-Zellen und alle verbleibenden Erythrozyten abzielen. T-Zellen werden nicht angegriffen und bleiben daher unmarkiert.
Fügen Sie als Nächstes der Suspension magnetische Anti-Biotin-Mikrokügelchen hinzu. Alle Biotin-markierten Zellen binden an die Mikrokügelchen. Unter dem Einfluss eines starken Magnetfeldes haften die magnetisch markierten Zellen an der Röhrenwand. Unmarkierte T-Zellen bleiben in Suspension. Sammeln Sie die ungebundenen angereicherten T-Zellen in ein frisches Sammelröhrchen. Im folgenden Protokoll zeigen wir die Isolierung von T-Zellen aus Milz und Lymphknoten der Maus unter Verwendung einer magnetischen Trenntechnik.
- Bündeln Sie die Lymphknoten und die Milz in einem 40-Mikrometer-Porensieb und mazerieren Sie das Gewebe mit einem Spritzenkolben durch die Filter, um die Zellen freizusetzen. Waschen Sie das Sieb und den Kolben mit RPMI-Medium, das mit 1 % FBS versetzt ist, um alle Zellen zu sammeln und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren. Geben Sie 5 Milliliter ACK-Lysepuffer zum Zellpellet
.Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Reaktion mit 5 Millilitern Medium, das mit 1 % FBS versetzt ist, stoppen und die weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern MACS-Puffer zum Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 2 mal 10 auf 8 Zellen pro Mikroliter in frischem MACS-Puffer. Geben Sie die entsprechende Konzentration von Anti-Erythroid-, Anti-Granulozyten-, Anti-B-Zell- und Anti-NK-Zell-Depletionsantikörpern pro 1 mal 10 zu den 6 Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 10 Millimeter eiskaltem MACS-Puffer und resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von 1 mal 10 auf 8 Zellen pro Milliliter in frischem MACS-Puffer. Als nächstes fügen Sie 0,22 Mikroliter Anti-Biotin-Mikrokügelchen pro 1 mal 10 zu den 6 Zellen mit Mischen für eine 15-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius hinzu.
Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern eiskaltem MACS-Puffer und sammeln Sie die ungebundenen angereicherten T-Zellen durch magnetische Bead-Trennung mit einem MACS-Express-Separator gemäß den Standard-Bead-Isolationsprotokollen. Am Ende der Trennung sedimentieren Sie die T-Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in 5 Millilitern frischem MACS-Puffer zur Zählung.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von T-Zellen aus murinen Milz- und Lymphknoten unter Verwendung magnetischer Trenntechniken beschrieben. Die Methode gewährleistet die selektive Anreicherung von T-Zellen bei gleichzeitiger Ausschleusung anderer Blutzelltypen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- T-Zellen sind entscheidend für die Immunantwort gegen Infektionen.
- Die Isolierung von T-Zellen ist für verschiedene immunologische Untersuchungen unerlässlich.
- Magnetische Trenntechniken bieten ein zuverlässiges Verfahren zur Zellisolierung.
- Das Verständnis des T-Zell-Verhaltens kann therapeutische Strategien maßgeblich beeinflussen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur effizienten Isolierung von T-Zellen.
- Verbesserung der Reinheit der isolierten T-Zellen für nachgeschaltete Anwendungen.
- Bereitstellung einer reproduzierbaren Methode für Forscher in der Immunologie.
Verwendete Methoden
- Homogenisierung von Milz und Lymphknoten zur Gewinnung einer Einzelzell-Suspension.
- Verwendung von ACK-Puffer zum Lyseieren der roten Blutkörperchen.
- Magnetische Trennung unter Verwendung von Anti-Biotin-Mikroperlen zur Isolierung von T-Zellen.
- Zentrifugation und erneute Suspension der T-Zellen zur Zählung und Analyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von T-Zellen mit hoher Reinheit.
- Effiziente Entfernung von Nicht-T-Zell-Populationen.
- Reproduzierbarkeit des Protokolls durch mehrfache Versuche bestätigt.
- Die isolierten T-Zellen zeigten die erwarteten funktionellen Eigenschaften.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist wirksam für die T-Zell-Isolierung.
- Magnetische Trenntechniken können die Forschung in der Immunologie verbessern.
- Weitere Anwendungen isolierter T-Zellen können zu Fortschritten in therapeutischen Strategien führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung reiner T-Zell-Populationen ist entscheidend für die Immunologieforschung, die Validierung von Zielstrukturen und die Entwicklung präklinischer Modelle in der Biopharma-Industrie. Die magnetische Trennung ermöglicht eine reproduzierbare Ausschaltung nicht-T-zelliger Populationen und unterstützt so die mechanistische Risikominimierung in der frühen Entdeckungsphase. Diese Technik bietet einen skalierbaren, standardisierten Arbeitsablauf zur Erzeugung krankheitsrelevanter Systeme, die in der Assay-Entwicklung und der Identifizierung von Leitverbindungen eingesetzt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der T-Zell-Funktion in immunologischen Signalwegen und die Validierung therapeutischer Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten, indem unberührte T-Zellen mittels negativer Selektion isoliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gereinigte T-Zell-Suspensionen, die für funktionelle Assays und phänotypische Untersuchungen geeignet sind.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch eine konsistente Zellisolierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt krankheitsrelevante Systeme zur Untersuchung der Transplantatabstoßung und immunologischen Modulation.
- Operationaler Wert: Bietet skalierbare Eingabe für präklinische Modelle, die definierte T-Zell-Populationen erfordern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich nahtlos in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Assay-Entwicklung bis hin zur präklinischen Evaluation ein und ermöglicht zuverlässige Verbindungstests in immunologisch ausgerichteten Pipelines.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung von T-Zellen für die Analyse von Signalwegen und funktionelle Validierung.
- Screening: Ermöglicht standardisierte, quantitative Zellpräparationen zum Screening von Immunmodulatoren oder Biologika.
- Analytik: Erzeugt zählbare, lebensfähige T-Zellpopulationen für nachgeschaltete Durchflusszytometrie, Zytokinfingerprinting oder Zytotoxizitätsassays.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis hin zu präklinischen Modellen immunvermittelter Erkrankungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Isolierung von T-Zellen über mehrere Projekte und therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem störende Variablen in Immunassays reduziert werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine hochgradige, reproduzierbare Anreicherung von T-Zellen mit minimalem manuellem Arbeitsaufwand.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung und Abbruch in der Immuntherapieentwicklung durch zuverlässige Daten zur Zielstrukturenbindung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten, die T-Zell-vermittelte Signalwege anvisieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunologie und magnetischen Zellseparationstechniken.
- Setzt den Zugang zu MACS-kompatiblen Separatoren, biotinylierten Antikörpern und Anti-Biotin-Mikroperlen voraus.
- Erfordert standardisierte Pufferbedingungen und Inkubationsprotokolle über alle Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Anpassung an humane oder Krankheitsmodellsysteme kann eine Optimierung des Antikörpersets erfordern.
- Wird durch die Qualität und Vitalität des Ausgangsgewebes nach mechanischer Dissoziation begrenzt.
Biopharma-Häufige Fragen
Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Bereichern Sie und erweitern Sie seltene antigenspezifischen T-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Magnetisch aktivierte Zellsortierung: Eine Methode zur Isolierung von C-Kit-positiven Zellen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Aufreinigung von CD31+ endothelialen Vorläuferzellen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolation und
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026