DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA von aktiven Mikroorganismen zu gewinnen, die ein interessantes Wachstumssubstrat ohne die Voraussetzung einer Laborkultivierung konsumiert haben. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Umweltprobe mit einem stabilen Isotopen-markierten Substrat von Interesse unter Bedingungen inkubiert wird, die denen in der natürlichen Umgebung ähneln. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Gesamt-DNA aus dieser isotopenmarkierten Probe zu extrahieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, diese DNA einer Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in Cäsiumchlorid zu unterziehen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Dichtegradienten zu fraktionieren, um schwere und leichte DNA für die anschließende molekulare Charakterisierung zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Identität aktiver, noch nicht kultivierter Mikroorganismen offenbaren, die am Metabolismus eines bestimmten Substrats beteiligt sind, und zwar durch eine Vielzahl möglicher molekularer Techniken, einschließlich Fingerabdruck, Microarray, Hybridisierung, Klon, Bibliotheksanalyse und Metagenomik.

Hallo, ich bin Josh Neufeld vom Department of Biology an der University of Waterloo. Ich bin Eric Dunford, ein Doktorand im Newfeld Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur DNAS-Isotopensondierung oder DNA-Sip, die sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt hat, um die Identität unbekannter und potenziell unkultivierter Mikroorganismen mit ihrer Fähigkeit zu verknüpfen, ein interessantes Wachstumssubstrat zu verwenden.

Wir verwenden dieses Verfahren im Newfeld-Labor, um den Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen in einer Vielzahl von terrestrischen und aquatischen Umgebungen zu untersuchen. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie ein bestimmtes Kohlenstoffsubstrat 13 C Glukose auf eine Bodenprobe auftragen. Wir erkennen jedoch an, dass die Forscher seit der Entwicklung dieser Methode durch die Gruppe von Colin Merle an der University of Warwick das Protokoll diversifiziert haben, um es auf eine Vielzahl verschiedener Umgebungen anzuwenden und auch eine Vielzahl unterschiedlicher markierter Isotope wie Stickstoff und Sauerstoff zu verwenden.

Heute konzentrieren wir uns auf Kohlenstoff, aber das Protokoll selbst kann auf verschiedene Versuchsdesigns angewendet werden. Also lasst uns loslegen. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens alle DNA-Stabilisotopensondierungen oder DNA-CYP-Reagenzien vor, wie im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben.

DNAC beginnt mit der Inkubation der Proben. Die Inkubationsbedingungen variieren stark, abhängig von einer Vielzahl von Proben- und Substrateigenschaften. Sobald die geeigneten Inkubationsbedingungen empirisch bestimmt wurden, geben Sie der Umweltprobe den entsprechenden Substratzusatz.

Sie können sich auch dafür entscheiden, zusätzliche Nährstoffe hinzuzufügen, um das mikrobielle Wachstum zu ermöglichen, wenn diese aufgrund von Testinkubationen erforderlich sind. Sobald die Probeninkubation eingerichtet ist, verschließen und verschließen Sie die Probe und inkubieren Sie dann die Umgebungsproben, die markiertes Substrat enthalten. Das gezeigte Beispiel beinhaltet die Zugabe einer mit Kohlenstoff-13 markierten Glukoselösung zu einer Bodenprobe.

Richten Sie als Nächstes eine Kontrollinkubation ein, die als Vergleich dient, um die in den nachfolgenden Schritten beobachtete scheinbare Markierung der Nukleinsäure zu bestätigen. Bereiten Sie diese Probe unter identischen Bedingungen vor, außer unter Verwendung von unmarkiertem Kohlenstoff als Substratkappe, versiegeln und inkubieren Sie die Umweltprobe mit unmarkiertem Substrat unter den gleichen Bedingungen nach der Inkubation, extrahieren Sie DNA aus dem Mikrokosmos unter Verwendung eines Extraktionsprotokolls, das für die gewünschten nachgeschalteten Anwendungen geeignet ist. Quantifizieren Sie dann die extrahierte DNA für die folgenden Ultrazentrifugationsschritte mit Hilfe eines Aous-Gels und eines Spektralphotometers.

Verwenden Sie vertikale oder nahezu vertikale Rotoren für die Ultrazentrifugation, um eine maximal mögliche Trennung von leichter und schwerer DNA zu gewährleisten. Der Rotor VTI 65.2 von Beckman Coulter verfügt über 16 Vertiefungen für die Aufnahme von 5,1-Milliliter-Polymerröhrchen mit Schnellverschluss zur Vorbereitung von Proben für die Ultrazentrifugation. Berechnen Sie zunächst das Volumen der extrahierten DNA, das erforderlich ist, um 0,5 bis fünf Mikrogramm DNA in die Ultrazentrifugenröhrchen zu geben.

Unter Verwendung der zuvor ermittelten DNA-Konzentrationen. Bestimmen Sie dann die genaue Dichte der Cäsiumchlorid-Stammlösung mit einem digitalen Refraktometer. Wie im schriftlichen Protokoll vorgeschlagen, ist das Volumen der Gradientenpuffer-DNA-Lösung zu berechnen, das erforderlich ist, um ein geeignetes Mischungsverhältnis zu erzeugen.

Kombinieren Sie anhand dieser Berechnungen die extrahierte DNA mit Gradientenpuffer und 4,8 Millilitern Cäsiumchlorid in einem sterilen 15-Milliliter-Einwegröhrchen. Das resultierende Volumen ist größer als die angegebene Kapazität der Zentrifugenröhrchen, um die Röhrchen vollständig zu füllen. Stellt schließlich die Lösung her, indem das Rohr 10 Mal Variationen dieses Protokolls umgedreht wird.

Verwenden Sie eine Flora-Kraft wie Ahy und Bromid in der Gradientenlösung, um die DNA im Röhrchen sichtbar zu machen. Die Veränderung der DNA-Dichte bei der Herstellung mit Reinkultur-DNA, einschließlich eines AUM-Bromid-Gradienten, wie hier gezeigt, ist besonders nützlich, um eine sofortige visuelle Bestätigung der Gradientenbildung nach jeder Zentrifuge zu ermöglichen. Die Ausführungsschritte bei Verwendung eines solchen Ansatzes sind im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Um die Ultrazentrifugation zuerst einzurichten, verwenden Sie einen Kolben und führen Sie eine Pipette durch, um die Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig mit den Gradientenlösungen zu füllen. Beschriften Sie die Röhrchen auf der Röhrchenschulter mit einem feinen Permanentmarker. Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen genau bis zum Boden des Röhrchenhalses gefüllt sind, da unzureichend gefüllte Röhrchen dazu neigen, während der Ultrazentrifugation zu platzen.

Sobald alle erforderlichen Röhrchen mit den Probenlösungen gefüllt sind, notieren Sie die genaue Masse jedes Röhrchens, sortieren Sie die Röhrchen als eng zusammengehörige Paare und fügen Sie meine neuen Lösungsmengen hinzu oder entfernen Sie sie, bis sie auf 10 Milligramm genau ausbalanciert sind. Halten Sie die Lösung so nah wie möglich am Boden des Röhrchens. Verschließen Sie dann die Röhrchen mit einem Röhrchenaufsatz nach Herstellerangaben.

Überprüfen Sie, ob die Schläuche richtig abgedichtet sind, indem Sie sie umdrehen und mäßigen Druck ausüben. Wiegen Sie die Röhrchen erneut, um zu überprüfen, ob sie nach dem Versiegeln vor der Ultrazentrifugation noch ausbalanciert sind. Überprüfen Sie jeden Rotor sorgfältig, um sicherzustellen, dass er sauber und frei von Staub und Schmutz ist, der die Röhrchen während der Ultrazentrifugation durchstechen könnte.

Setzen Sie die Rohre in den Rotor ein und platzieren Sie die symmetrischen Paare gegenüber. Notieren Sie die Rotorposition jeder Probe, da der Ultrazentrifugationsprozess die Markierungsetiketten lesbar machen kann. Verschließen Sie die Rotorschächte sorgfältig wie vom Hersteller angegeben.

Sobald die Rotorvertiefungen abgedichtet sind, laden Sie den Rotor in die Ultrazentrifuge. Schließen Sie die Ultrazentrifugentür und legen Sie ein Vakuum für den VTI 65.2-Rotor an. Stellen Sie die Drehzahl auf 44, 100 U/min, die Temperatur auf 20 Grad Celsius und die Ultrazentrifugationszeit auf 36 bis 40 Stunden ein.

Stellen Sie sicher, dass das Vakuum eingeschaltet ist, wählen Sie die maximale Beschleunigung und schalten Sie die Bremse aus, um sicherzustellen, dass die Steigung nicht durch Verzögerung unterbrochen wird. Unmittelbar nach der Ultrazentrifugation den Rotor vorsichtig ausbauen. Achten Sie darauf, den Rotor nicht zu kippen oder zu stoßen, um die Gradienten in den Rohren nicht zu stören.

Entfernen Sie abschließend vorsichtig die Röhrchen für die Gradientenfraktionierung. Die DNA kann mit der Fraktionierungstechnik aus den Ultrazentrifugenröhrchen extrahiert werden. Füllen Sie zunächst eine sterile 60-Milliliter-Spritze mit sterilem destilliertem und entionisiertem Wasser, das ausreichend Propofolblau-Farbstoff enthält.

Um eine dunkelblaue Farbe zu erhalten, platzieren Sie die Spritze auf dem Ladearm der Spritzenpumpe. Befestigen Sie dann einen Pumpenschlauch, der mit einer 23-Gauge-1-Zoll-Nadel ausgestattet ist, und schalten Sie die Pumpe ein, bis etwas Wasser durch das Ende der Nadel kommt. Vermeiden Sie Luftblasen in der Wasserversorgung, da diese den Fraktionierungsprozess negativ beeinflussen.

Bereiten Sie für jede Probe 12 sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Etiketten vor, auf denen die Probennummer und die Fraktion angegeben sind. Befestigen Sie anschließend eines der Ultrazentrifugationsröhrchen mit einer schnellen und kontrollierten Bewegung an einem Klemmständer. Durchstechen Sie den Boden des Rohrs entlang der Rohrnaht mit einer frischen 23-Gauge-1-Zoll-Nadel und drehen Sie die Nadel, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Loch gebildet wurde.

Möglicherweise stellen Sie fest, dass Latexhandschuhe einen besseren Halt am Nadelschaft bieten als Nitrilhandschuhe. Mit der Nadel, die am Pumpenschlauch befestigt ist, stechen Sie schnell und kontrolliert in die Oberseite des Schlauchs an der oberen Rohrschulter entlang der Naht. Beachten Sie, dass das Durchstechen der Oberseite des Rohrs gefolgt von der Unterseite des Rohrs auch möglich ist.

Beachten Sie auch, dass eine kleine Menge Mineralöl, die die Schulter des Schlauchs beschichtet, dazu beitragen kann, ein Auslaufen durch eine unsachgemäße Abdichtung um die obere Nadel mit einer zuvor kalibrierten Pumprate zu verhindern. Pumpen Sie das gefärbte Wasser in den oberen Teil der Tube, um in 12 Minuten 12 425 Mikroliterfraktionen zu erhalten. Verwenden Sie einen Timer, um die Gradientenlösung in den beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.

Überprüfen Sie abschließend die Dichte aller Fraktionen für mindestens eine Probe oder einen Kontrollgradienten. Mit einem digitalen Refraktometer. Erwarten Sie Werte im Bereich von 1,690 bis 1,760 Gramm pro Milliliter mit einer mittleren Dichte von etwa 1,725 Gramm pro Milliliter, um DNA aus allen Fraktionen auszufällen.

Zuerst werden 20 Mikrogramm lineares Polyacrylamid als Träger für die Fällung hinzugefügt und durch Inversion gemischt. Fügen Sie dann zwei Volumina PEG-Lösung hinzu und mischen Sie erneut durch Inversion. Lassen Sie die Röhrchen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, damit sich die DNA nach der Inkubation ausfällen kann.

Legen Sie die Proben in eine Mikrozentrifuge, wobei die Röhrchen in die gleiche Richtung ausgerichtet sind, um eine konsistente Lokalisierung der Pelletzentrifuge zu gewährleisten. Die Röhrchen bei 13.000 g für 30 Minuten nach der Zentrifugation entnahmen die Proben aus der Mikrozentrifuge, aspirierten sie dann vorsichtig und entsorgten die Supernat-App. Zu diesem Zeitpunkt sollte das Pellet mit Hilfe einer hellen Lichtquelle sichtbar sein.

Waschen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern 70%igem Ethanol, nachdem Sie die Pelletzentrifuge gewaschen haben. Die Proben, die nach der Zentrifugation 10 Minuten lang bei 13.000 g gehalten werden, aspirieren das Supernat vorsichtig und verwerfen es. Das Pellet ist jetzt besser sichtbar, löst sich aber leichter von der Rohrwand.

Lassen Sie das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Sobald die Pellets getrocknet sind, suspendieren Sie jedes Pellet in 50 Mikrolitern TE-Puffer. Lassen Sie schließlich fünf Mikroliter jeder Fraktion auf einem Aeros-Gel laufen, um die Gradientenfraktionen mit Methoden zu charakterisieren, die im schriftlichen Protokoll besprochen werden.

Typische DNA-SIP-Ergebnisse zeigen eine Trennung von markierter und unmarkierter DNA in der Gradientenform durch Ultrazentrifugation. Im Idealfall wird es eine vollständige Auflösung von genetischem Material mit hohem Molekulargewicht wie Kohlenstoff-13 und Stickstoff-15 aus unmarkiertem Material geben, insbesondere aus unmarkiertem Material, einzigartige PCR-basierte Fingerabdrücke, die mit den Fraktionen vier bis acht von inkubierten Proben mit stabilen Isotopen assoziiert sind, aber nicht mit nativem Substrat. Inkubierte Kontrollen liefern starke Beweise für einen Zusammenhang zwischen bestimmten Organismen und dem Metabolismus eines bestimmten markierten Substrats, wenn sie an DNA aus zwei Reinkulturen durchgeführt werden, dem mit Kohlenstoff-13 markierten Methyl-Occus-Kapsulitis-Stammbad und dem unmarkierten Sian medi A TCC 10 21, das als unmarkierte genomische DNA markiert ist, und trennen sich in angesehene Gradientenfraktionen mit unterschiedlichen Dichten.

In diesem Beispiel kann mit schweren Isotopen markierte DNA in den Fraktionen vier bis fünf beobachtet werden, während unmarkierte DNA in den Fraktionen neun bis 10 in hohen Konzentrationen gefunden wird. PCR-amplifizierte DNA aus denselben Fraktionen wurde mittels Denaturierungs- und Gradientengelelektrophorese (DGGE) durchgeführt und erzeugte diskrete Bandenmuster, die den beiden im Gradienten enthaltenen Organismen entsprachen. Die Dichte der Fraktionen reicht von etwa 1,580 bis 1,759 Gramm pro Milliliter, und sie sind in der Reihenfolge abnehmender Dichte von links nach rechts dargestellt.

Umgekehrt kann die Trennung von Isotopen und die Inkubation von Umweltproben schwieriger zu interpretieren sein. Tundraböden aus der Resolute Bay, Kanada, wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen bei 15 Grad Celsius entweder mit Kohlenstoff-12 oder Kohlenstoff-13-markierter Glukose inkubiert. Die Aeros-Gele der gereinigten Gradientenfraktions-DNA zeigten Abstrich-genomische DNA über die Fraktionen sieben bis 10 sowohl für Kohlenstoff-12- als auch für Kohlenstoff-13-Inkubationen.

Als jedoch DGGE von 16 s ribosomalen RNA-Genen verwendet wurde, um die Kohlenstoff-13-Anreicherung von Biomasse aus bestimmten mikrobiellen Taxa, dem mit Kohlenstoff-12-Glukose inkubierten Boden, zu bestimmen, erzeugte die DNA ähnliche Muster über alle Gradientenfraktionen hinweg, während die mit Kohlenstoff-13-Glukose inkubierte Probe DGG-Fingerabdrücke erzeugte, die eindeutig mit den Fraktionen fünf bis acht assoziiert sind. Die durch die Pfeile angezeigten konservierten Bänder stellten den dominanten Phylo-Typ dar, der über alle Gradientenfraktionen hinweg konsistent war. Der Phylo-Typ verschiebt sich zu schwereren Fraktionen für DNA, die aus Kohlenstoff-13-Glukose-inkubiertem Boden gewonnen wird. Die Identität dieses speziellen ribosomalen RNA-Gens von 16 s kann bestimmt werden, um nachfolgende metagenomische oder kultivierungsbasierte Ansätze zu leiten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Experiment zur Sondierung stabiler DNA-Isotope durchführen, von der Inkubation von Proben bis zur Gewinnung markierter DNA für die molekulare Analyse. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie Ihr Versuchsdesign sorgfältig prüfen und darauf achten, nicht zu viel Substrat hinzuzufügen, um zu vermeiden, dass Ihr Experiment auf schnell wachsende Organismen ausgerichtet ist. Sie sollten auch eine verlängerte Inkubation vermeiden, damit das Substrat nicht durch ein Nahrungsnetz an andere Mitglieder einer Gemeinschaft verdünnt wird.

Sie möchten also genau die richtige Menge an Substrat und gerade ausreichend Inkubationszeiten verwenden, um kleine Mengen markierter DNA in schweren Fraktionen mit empfindlichen PCR-basierten Anwendungen nachweisen zu können. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.