DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA aus aktiven Mikroorganismen zu gewinnen, die ein Wachstumssubstrat der Wahl konsumiert haben, ohne dass eine Laboranreicherung erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Umweltprobe unter Bedingungen, die denen der nativen Umgebung ähneln, mit einem stabilisotopenmarkierten Substrat der Wahl inkubiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die gesamte DNA aus dieser isotonmarkierten Probe zu extrahieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, diese DNA einer Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in Cäsiumchlorid zu unterziehen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fraktionierung des Dichtegradienten, um schwere und leichte DNA für eine anschließende molekulare Charakterisierung zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Identität aktiver, aber nicht kultivierter Mikroorganismen offenbaren, die am Stoffwechsel eines bestimmten Substrats beteiligt sind, und zwar mittels einer Vielzahl möglicher molekularer Techniken, einschließlich Fingerabdruckanalyse, Mikroarray, Hybridisierung, Klon-, Bibliotheksanalyse und Metagenomik.

Hallo, ich bin Josh Neufeld vom Department für Biologie an der University of Waterloo. Ich bin Eric Dunford, ein Doktorand im Newfeld-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur DNA-Isotopenmarkierung, oder DNA-SIP, das zu einer weit verbreiteten Technik geworden ist, um die Identität unbekannter und möglicherweise nicht kultivierbarer Mikroorganismen mit ihrer Fähigkeit, ein Substrat des Interesses für das Wachstum zu nutzen, zu verknüpfen.

Wir verwenden dieses Verfahren im Newfeld-Labor, um den Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen in einer Vielzahl terrestrischer und aquatischer Umgebungen zu untersuchen. Heute zeigen wir Ihnen die Anwendung eines bestimmten Kohlenstoffsubstrats, 13C-Glukose, an einer Bodenprobe. Wir weisen jedoch darauf hin, dass Forscher die Methode seit ihrer ersten Entwicklung durch die Gruppe von Colin Merle an der University of Warwick erweitert haben, sodass sie nun auf eine Vielzahl unterschiedlicher Umgebungen sowie mit verschiedenen markierten Isotopen wie Stickstoff und Sauerstoff angewendet werden kann.

Heute konzentrieren wir uns auf Kohlenstoff, doch das Protokoll selbst kann auf verschiedene experimentelle Designs angewendet werden. Beginnen wir also. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens alle Reagenzien für die DNA-Stabilisotopenmarkierung oder DNA-CYP gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.

DNAC beginnt mit der Inkubation der Probe. Die Inkubationsbedingungen variieren stark, abhängig von einer Vielzahl von Merkmalen der Probe und des Substrats. Sobald geeignete Inkubationsbedingungen empirisch bestimmt wurden, fügen Sie die geeignete Substratzugabe zur Umweltprobe hinzu.

Sie können auch zusätzliche Nährstoffe hinzufügen, um das mikrobielle Wachstum zu ermöglichen, falls dies aufgrund von Testinkubationen erforderlich ist. Sobald die Probennkubation eingerichtet wurde, verschließen und versiegeln Sie die Probe und inkubieren Sie anschließend die Umweltproben, die markiertes Substrat enthalten. Das gezeigte Beispiel beinhaltet die Zugabe einer Kohlenstoff-13-markierten Glucoselösung zu einer Bodenprobe.

Als Nächstes richten Sie eine Kontrollinkubation ein, die als Vergleich dient, um die sichtbare Markierung von Nukleinsäuren, die in nachfolgenden Schritten beobachtet wird, zu bestätigen. Bereiten Sie diese Probe unter identischen Bedingungen vor, verwenden jedoch unmarkierten Kohlenstoff als Substrat. Verschließen und inkubieren Sie die Umweltprobe mit unmarkiertem Substrat unter denselben Bedingungen. Führen Sie danach die Extraktion von DNA aus den Mikrokosmen mithilfe eines Extraktionsprotokolls durch, das für die gewünschten nachgeschalteten Anwendungen geeignet ist. Quantifizieren Sie anschließend die extrahierte DNA für die folgenden Ultrazentrifugationsschritte mittels Agarosegel und eines Spektrophotometers.

Verwenden Sie vertikale oder nahezu vertikale Rotoren für die Ultrazentrifugation, um eine möglichst maximale Trennung von leichter und schwerer DNA zu gewährleisten. Der Beckman Coulter VTI 65.2-Rotor verfügt über 16 Vertiefungen zur Aufnahme von 5,1-Milliliter-Quick-Seal-Polymerrohren zur Probenvorbereitung für die Ultrazentrifugation. Berechnen Sie zunächst das Volumen der extrahierten DNA, das notwendig ist, um den Ultrazentrifugenröhrchen 0,5 bis fünf Mikrogramm DNA hinzuzufügen.

Unter Verwendung der zuvor bestimmten DNA-Konzentrationen. Bestimmen Sie anschließend die genaue Dichte der Cäsiumchlorid-Stammlösung mithilfe eines digitalen Refraktometers. Wie im schriftlichen Protokoll vorgeschlagen, berechnen Sie das Volumen an Gradientenpuffer-DNA-Lösung, das erforderlich ist, um ein geeignetes Mischverhältnis zu erzeugen.

Unter Verwendung dieser Berechnungen kombinieren Sie die extrahierte DNA mit Gradientenpuffer und 4,8 Milliliter Cäsiumchlorid in einem sterilen, Einweg-15-Milliliter-Röhrchen. Das resultierende Volumen wird größer sein als die angegebene Kapazität der Zentrifugenröhrchen, um diese vollständig zu füllen. Schließlich wird die Lösung durch 10-maliges Invertieren des Röhrchens hergestellt, Variante dieses Protokolls.

Verwenden Sie eine Dichtegradientenlösung mit einem Flora-Kraft-Mittel wie Ahy und Bromid, um die DNA im Reagenzglas sichtbar zu machen. Die Veränderung der DNA-Dichte bei Verwendung von reiner Kultur-DNA, einschließlich eines AUM-Bromid-Gradienten wie hier gezeigt, ist besonders nützlich, um unmittelbar nach jeder Zentrifugation eine visuelle Bestätigung der Gradientenbildung zu erhalten. Die Schritte zur Anwendung dieses Ansatzes sind im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Um die Ultrazentrifugation vorzubereiten, verwenden Sie eine Pipettenhilfe und eine Pipette, um die Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig mit den Gradientenlösungen zu füllen. Beschriften Sie die Röhrchen am Röhrchenschaft mit einem feinen Permanentstift. Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen genau bis zur Basis des Röhrchenhalses gefüllt sind, da unzureichend gefüllte Röhrchen während der Ultrazentrifugation platzen können.

Nachdem alle erforderlichen Röhrchen mit den Probelösungen gefüllt sind, notieren Sie die genaue Masse jedes Röhrchens, sortieren Sie die Röhrchen in möglichst passende Paare und fügen Sie geringe Mengen der Lösung hinzu oder entfernen Sie sie, bis die Paare auf maximal 10 Milligramm genau ausbalanciert sind. Halten Sie den Füllstand der Lösung so nah wie möglich an der Basis des Röhrchens. Verschließen Sie die Röhrchen anschließend mit einem Röhrchenstopfen gemäß den Herstelleranweisungen.

Überprüfen Sie, ob die Röhrchen richtig verschlossen sind, indem Sie sie umdrehen und mäßigen Druck ausüben. Wiegen Sie die Röhrchen erneut, um sicherzustellen, dass sie nach dem Verschließen vor der Ultrazentrifugation weiterhin ausbalanciert sind. Untersuchen Sie jedes Rotortablett sorgfältig, um sicherzustellen, dass es sauber ist und frei von jeglichem Staub und Schmutz, der die Röhrchen während der Ultrazentrifugation beschädigen könnte.

Setzen Sie die Röhrchen in den Rotor ein, wobei die ausgewogenen Paare sich gegenüberliegen müssen. Notieren Sie die Rotorposition jeder Probe, da der Ultrazentrifugationsprozess die Markierungsbeschriftungen unleserlich machen kann. Verschließen Sie die Rotoröffnungen sorgfältig gemäß den Herstellerangaben.

Nachdem die Rotortöpfe verschlossen wurden, den Rotor in das Ultrazentrifugengerät einsetzen. Die Tür der Ultrazentrifuge schließen und für den VTI 65.2 Rotor ein Vakuum erzeugen. Die Drehzahl auf 44.100 U/min, die Temperatur auf 20 Grad Celsius und die Ultrazentrifugationsdauer auf 36 bis 40 Stunden einstellen.

Stellen Sie sicher, dass das Vakuum eingeschaltet ist, wählen Sie die maximale Beschleunigung aus und schalten Sie die Bremse aus, um sicherzustellen, dass die Gradientenbildung nicht durch Verzögerung gestört wird. Unmittelbar nach der Ultrazentrifugation den Rotor vorsichtig entfernen. Achten Sie darauf, den Rotor nicht zu kippen oder anzustoßen, um die Gradienten in den Röhrchen nicht zu stören.

Entfernen Sie abschließend vorsichtig die Röhrchen zur Gradientenfraktionierung. Die DNA kann aus den Ultrazentrifugenröhrchen mithilfe der Fraktionierungstechnik gewonnen werden. Füllen Sie zunächst eine sterile 60-Milliliter-Spritze mit steriler, destillierter und deionisierter Wasser, das ausreichend Propofol-Blaufärbemittel enthält.

Um eine dunkelblaue Farbe zu erzielen, setzen Sie die Spritze auf den Ladearm der Spritzenpumpe. Befestigen Sie dann eine Pumpeleitung mit einer 23-Gauge-ein-Zoll-Nadel und schalten Sie die Pumpe ein, bis etwas Wasser aus der Nadelspitze austritt. Vermeiden Sie Luftblasen in der Wasserversorgung, da diese den Fraktionierungsprozess negativ beeinflussen würden.

Für jede Probe bereiten Sie 12 sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Beschriftungen vor, die die Probennummer und Fraktion angeben. Befestigen Sie anschließend eines der Ultrazentrifugenröhrchen mit einer schnellen und kontrollierten Bewegung an einem Klemmstativ. Durchstechen Sie den Boden des Röhrchens entlang der Naht mit einer frischen 23-Gauge-Ein-Zoll-Nadel und drehen Sie die Nadel, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Loch entstanden ist.

Möglicherweise stellen Sie fest, dass Latexhandschuhe einen besseren Halt am Nadelschaft bieten als Nitrilhandschuhe. Mit der Nadel, die an dem Pumpline angeschlossen ist, durchstechen Sie die Oberseite des Röhrchens an der oberen Röhrchenkante entlang der Naht schnell und kontrolliert. Beachten Sie, dass auch das Durchstechen der Oberseite des Röhrchens gefolgt vom Durchstechen der Unterseite möglich ist.

Beachten Sie außerdem, dass eine geringe Menge an Mineralöl, die die Schulter des Röhrchens bedeckt, helfen kann, ein Auslaufen aufgrund einer unsachgemäßen Abdichtung um die obere Nadel bei einer zuvor kalibrierten Pumpgeschwindigkeit zu verhindern. Pumpen Sie das gefärbte Wasser in die Oberseite des Röhrchens, um 12 Fraktionen mit jeweils 425 µL innerhalb von 12 Minuten zu erhalten. Verwenden Sie einen Timer, um die Gradientenlösung in beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.

Überprüfen Sie abschließend die Dichte aller Fraktionen für mindestens eine Probe oder ein Kontrollgradient mit einem digitalen Refraktometer. Erwarten Sie Werte im Bereich von 1,690 bis 1,760 Gramm pro Milliliter mit einer mittleren Dichte von etwa 1,725 Gramm pro Milliliter, um DNA aus allen Fraktionen auszufällen.

Fügen Sie zunächst 20 Mikrogramm lineares Polyacrylamid als Träger für die Präzipitation hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen. Geben Sie anschließend zwei Volumina PEG-Lösung hinzu und mischen Sie erneut durch Umstülpen. Lassen Sie die Röhrchen zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen, um die DNA-Präzipitation nach der Inkubation zu ermöglichen.

Die Proben wurden in eine Mikrozentrifuge gegeben, wobei die Röhrchen in dieselbe Richtung ausgerichtet wurden, um eine konsistente Lokalisation des Pellets während der Zentrifugation sicherzustellen. Die Röhrchen wurden bei 13.000 G für 30 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Proben aus der Mikrozentrifuge entnommen und anschließend vorsichtig der Überstand abgesaugt und verworfen. An dieser Stelle sollte das Pellet mit Hilfe einer hellen Lichtquelle sichtbar sein.

Waschen Sie das Pellet nach der Zentrifugation mit 500 µL 70%igem Ethanol. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 ×g für 10 Minuten und aspirieren Sie anschließend vorsichtig und verwerfen Sie die Überstände. Das Pellet ist nun deutlicher sichtbar, löst sich aber leichter von der Röhrenwand.

Lassen Sie das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Sobald die Pellets getrocknet sind, resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 µL TE-Puffer. Führen Sie abschließend fünf µL jeder Fraktion auf einem Agarosegel lauf, um die Gradientenfraktionen mit den in der schriftlichen Anleitung beschriebenen Methoden zu charakterisieren.

Typische DNA-SIP-Ergebnisse zeigen eine Trennung markierter und unmarkierter DNA in der Dichtegradientenzentrifugation. Idealerweise erfolgt eine vollständige Auftrennung von genetischem Material hohen Molekulargewichts, wie Kohlenstoff-13- und Stickstoff-15-markiertem, von unmarkiertem Material, insbesondere eindeutige, PCR-basierte Fingerabdrücke, die mit den Fraktionen vier bis acht stabiler Isotopen-inkubierter Proben assoziiert sind, jedoch nicht mit der nativen Substanz. Inkubierte Kontrollen liefern starke Hinweise darauf, dass bestimmte Organismen den Stoffwechsel einer spezifischen markierten Substrat verbinden, wenn sie an DNA zweier Reinkulturen durchgeführt werden: Kohlenstoff-13-markierte Methylomonas capsulatus Strain Bath und unmarkierte Cyanobakterien-Art Synechococcus sp. ATCC 1021. Markierte und unmarkierte genomische DNA trennen sich in entsprechende Gradientenfraktionen mit unterschiedlichen Dichten.

In diesem Beispiel kann DNA mit schweren Isotopenmarkierungen in den Fraktionen vier bis fünf beobachtet werden, während unmarkierte DNA in hohen Konzentrationen in den Fraktionen neun bis zehn vorkommt. PCR-amplifizierte DNA aus denselben Fraktionen wurde mittels Denaturierungs- und Gradientengelelektrophorese (DGGE) analysiert und ergab diskrete Bandenmuster, die den beiden im Gradienten enthaltenen Organismen entsprechen. Die Dichte der Fraktionen reicht von etwa 1,580 bis 1,759 Gramm pro Milliliter, und sie sind von links nach rechts in abnehmender Dichte angeordnet.

Umgekehrt können die Trennung von Isotopen und die Inkubationen von Umweltproben schwieriger zu interpretieren sein. Tundraböden aus Resolute Bay in Kanada wurden entweder mit Kohlenstoff-12- oder Kohlenstoff-13-markierter Glukose über einen Zeitraum von 14 Tagen bei 15 °C inkubiert. Die Agar-Gele der gereinigten Gradientenfraktionen der DNA zeigten eine verschmierte genomische DNA über die Fraktionen sieben bis zehn hinweg, und zwar sowohl bei den Kohlenstoff-12- als auch bei den Kohlenstoff-13-Inkubationen.

Jedoch, wenn die DGGE der 16S-rRNA-Gene verwendet wurde, um die Kohlenstoff-13-Anreicherung der Biomasse bestimmter mikrobieller Taxa zu bestimmen, zeigten die aus dem mit Kohlenstoff-12-Glukose inkubierten Boden gewonnene DNA ähnliche Muster über alle Gradientenfraktionen hinweg, während die Probe aus dem mit Kohlenstoff-13-Glukose inkubierten Boden DGGE-Fingerabdrücke ergab, die eindeutig den Fraktionen fünf bis acht zugeordnet waren; die durch die Pfeile markierten konservierten Banden repräsentierten einen dominanten Phylotyp, der über alle Gradientenfraktionen hinweg konsistent war. Der Phylotyp verschob sich bei der aus dem mit Kohlenstoff-13-Glukose inkubierten Boden gewonnenen DNA in schwerere Fraktionen. Die Identität dieses speziellen 16S-rRNA-Gens kann bestimmt werden, um nachfolgende metagenomische oder kultivierungsbasierte Ansätze zu leiten.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man ein DNA-Stabilisotopenmarkierungsexperiment von der Inkubation der Proben bis zur Gewinnung markierter DNA für die molekularbiologische Analyse durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das experimentelle Design sorgfältig zu planen, und darauf zu achten, dass nicht zu viel Substrat zugegeben wird, um eine Verzerrung des Experiments zugunsten schnell wachsender Organismen zu vermeiden. Außerdem sollten Sie eine zu lange Inkubation vermeiden, damit das Substrat nicht über eine Nahrungsnetzwerk auf andere Mitglieder einer Gemeinschaft übertragen wird.

Sie möchten also genau die richtige Menge Substrat und ausreichende Inkubationszeiten verwenden, um geringe Mengen markierter DNA in schweren Fraktionen mittels empfindlicher PCR-basierter Anwendungen nachweisen zu können. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.