Name: DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Lernen Sie DNA-Stabilisotopen-Sondierung zur Identifizierung aktiver Mikroorganismen ohne Kultivierung. Diese Methode nutzt schwere Isotope zur Analyse mikrobieller DNA in Umweltproben.

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Diese Arbeit wurde von Strategic Project and Discovery Zuschüsse an JDN aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt.

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

Eine sachgerechte Konstruktion der stabilen Isotopen Experimente ist von entscheidender Bedeutung für den Erhalt von markierter DNA vor dem Hintergrund unbeschrifteten Gemeinschaft. Überlegungen im Zusammenhang mit Inkubationszeiten Substratkonzentrationen, Inkubationsbedingungen (z. B. Nährstoffe, Feuchtigkeitsgehalt des Bodens), Cross-Fütterung und Replikation Probe wurden an anderer Stelle 10,18 und diskutiert, empfehlen wir dem Leser wenden diese Veröffentlichungen bei der Gestaltung eines SIP Inkubation....

<table><tbody><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Cäsiumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>Äthanol, Reinstgrad</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>Äthidiumbromid</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>Lineares Polyacrylamid</td><td>Reagenz</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 6000</td><td>Reagenz</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid-Perlen</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader</td><td>Ausstattung</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Ausstattung</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Ausstattung</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td><td>Ausstattung</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>Modellnummer: BSP&lt;br/&gt;Siehe &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt; für Bestellinformationen.</td></tr><tr><td>Schlauchversiegelungsgerät</td><td>Ausstattung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Ausstattung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenrotor</td><td>Ausstattung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolettlampe</td><td>Ausstattung</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>Jede UV-Lichtquelle ist geeignet</td></tr><tr><td>UV-Schutzgesichtsschirm</td><td>Ausstattung</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>Butylkautschukstopfen, grau</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Material</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermikannadel, 23 Gauge, 2&amp;#8221; Länge</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>Offene Zentralsiegel, 20 mm Durchmesser</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten, Glas</td><td>Material</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>Katalognummer bezieht sich auf 200 &amp;#x03BC;l-Spitzen. 10- oder 20-&amp;#x03BC;l-Spitzen können bei derselben Quelle erworben werden</td></tr><tr><td>Pumpenschlauch, 1,5 mm Bohrung × 1,5 mm Wandstärke</td><td>Material</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlussröhrchen, 15 mL</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>Serumfläschchen, 125 mL Fassungsvermögen</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 60 mL</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

dna stable-isotope probing (dna-sip)

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stabilen Isotopen (DNA-SIP) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Identifizierung von aktiven Mikroorganismen, insbesondere Kohlenstoff-Substraten und Nährstoffe in zelluläre Biomasse zu assimilieren. Als solcher hat dieser Anbau-unabhängige Technik eine wichtige Methodik für die Vergabe metabolische Funktion, um die verschiedenen Gemeinschaften bewohnen eine Vielzahl von terrestrischen und aquatischen Umgebungen. Nach der Inkubation eines Umwelt-Probe mit stabilen Isotopen markierten Verbindungen, extrahiert Nukleinsäure Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die anschließende Steigung Fraktionierung unterzogen, um Nukleinsäuren unterschiedlicher Dichte zu trennen. Reinigung von DNA aus Cäsiumchlorid ruft beschriftet und unbeschriftet DNA für die anschließende molekulare Charakterisierung (z. B. Fingerabdrücke, Microarrays, Klon-Bibliotheken, Metagenomik). Diese JoVE Video-Protokoll bietet visuelle Schritt-für-Schritt-Erklärungen für das Protokoll für die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, Gradienten Fraktionierung und Rückgewinnung von markierten DNA. Das Protokoll enthält außerdem Beispielcode SIP Daten und hebt wichtige Tipps und Hinweise, die zu berücksichtigen, um eine erfolgreiche DNA-SIP-Analyse zu gewährleisten.

DNA stabilen Isotopen ist ein Anbau-unabhängige Methode zur Identifizierung und Charakterisierung aktiver Gemeinschaften von Mikroorganismen, die fähig werden bestimmte Substrate sind. Assimilation von Substrat in schweren Isotop angereichert führt zu Einbau von markierten Atome in mikrobielle Biomasse. Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ruft markierter DNA für nachgeschaltete molekulare Analysen.

Das DNA-Stable-Isotope Probing (DNA-SIP) ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung aktiver Mikroorganismen, die bestimmte Kohlenstoffsubstrate assimilieren und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA aus aktiven Mikroorganismen zu gewinnen, die ein Wachstumssubstrat der Wahl konsumiert haben, ohne dass eine Laboranreicherung erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Umweltprobe unter Bedingungen, die denen der nativen Umgebung ähneln, mit einem stabilisotopenmarkierten Substrat der Wahl inkubiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die gesamte DNA aus dieser isotonmarkierten Probe zu extrahieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, diese DNA einer Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in Cäsiumchlorid zu unterziehen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fraktionierung des Dichtegradienten, um schwere und leichte DNA für eine anschließende molekulare Charakterisierung zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Identität aktiver, aber nicht kultivierter Mikroorganismen offenbaren, die am Stoffwechsel eines bestimmten Substrats beteiligt sind, und zwar mittels einer Vielzahl möglicher molekularer Techniken, einschließlich Fingerabdruckanalyse, Mikroarray, Hybridisierung, Klon-, Bibliotheksanalyse und Metagenomik.Hallo, ich bin Josh Neufeld vom Dep

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Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Die aktive Bakteriengemeinschaft mit dem Darm von Spodoptera littoralis verbunden sind, wurde von stabilen Isotopen-Probing (SIP) zu Pyrosequenzierung gekoppelt bestimmt. Mit dieser Methode wurde die Identifizierung der metabolisch aktiven Bakterienarten innerhalb der Gemeinde mit hoher Auflösung und Genauigkeit durchgeführt.

Bezeichnung des metabolisch aktiven Bakterien im Darm der Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Über DNA Stable Isotope Probing Mit<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für T4 Ligatur und Geruchsstoffen Seite Reinigung der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, Glühen und native Seitenanalyse der kreisförmigen Platten, Montage und AFM Imaging von 1D und 2D DNA Nanostrukturen sowie Agarose-gel Elektrophorese und Zentrifugation Reinigung des endlichen DNA Nanostrukturen.

Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte &gt;4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

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Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

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Das Protokoll enthält Anweisungen zur Modifizierung von RNA mit Dimethylsulfat für Mutationsprofilierungsexperimente. Es umfasst in vitro und in vivo Sondierung mit zwei alternativen Bibliothekspräparationsmethoden.

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Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

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