Magnetisch aktivierte Zellsortierung: Eine Methode zur Isolierung von C-Kit-positiven Zellen

- c-Kit oder CD117 ist ein Tyrosinkinase-Transmembranrezeptor, der von hämatopoetischen Stamm- oder Vorläuferzellen exprimiert wird, die im Knochenmark und im Blut vorhanden sind. Es ist auch ein Marker zum Nachweis der akuten myeloischen Leukämie.

Um c-Kit-positive Zellen zu isolieren, werden murine Beinknochen entnommen und zerkleinert, um das Knochenmark von innen freizusetzen. Filtern Sie die Knochenmarksuspension, um Knochenfragmente zu entfernen. Das Filtrat, das Knochenmarkzellen enthält, wird auf ein Dichtegradientenmedium aufgetragen und zentrifugiert, um mononukleäre Zellen von anderen Fraktionen zu trennen.

Sammeln Sie die trübe Schicht der mononukleären Zellen in einem Röhrchen mit Mikrokügelchen, die an Anti-CD117-Mausantikörper konjugiert sind. Inkubieren Sie, damit die Antikörper-Bead-Komplexe an die CD117-Rezeptoren auf c-Kit-positiven Zellen binden können. Führen Sie die inkubierte Suspension durch eine magnetische Säule, die in einem Magnetfeld platziert ist. Alle c-Kit-positiven Zellen, die mit den magnetischen Mikrokügelchen markiert sind, verbleiben in der Säule, während die unmarkierten Zellen hindurchgehen.

Nehmen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und spülen Sie den Inhalt mit einem geeigneten Puffer, um c-Kit-positive Zellen zu eluieren. Im folgenden Protokoll zeigen wir die Isolierung von c-Kit-positiven Zellen aus dem Knochenmark einer transgenen Maus.

- Entnehmen Sie zunächst die Beinknochen einer euthanasierten Maus. Reinigen Sie das Taschentuch mit einem Skalpell von den Knochen. Legen Sie dann die Knochen in kaltes PBS auf Eis und zerkleinern Sie die Knochen mit einem Stößel. Danach filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen mit einer 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie den Mörser und den Stößel mehrmals mit kaltem PBS und geben Sie die Zellsuspension in das 50-Milliliter-Röhrchen.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Knochenmark und entfernen den Überstand mit Vakuum und Glaspipette. Resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern PBS. Geben Sie mit einer Pipette das suspendierte Knochenmark langsam auf die Polysaccharose bei Raumtemperatur.

Danach die Polysaccharose bei ausgeschalteter Bremse 20 Minuten lang bei 400 G drehen. Nach der Cetrifugation wird die trübe mononukleäre Zellgrenzfläche mit einer Pipette gesammelt und in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Bringen Sie das Volumen mit PBS auf 10 Milliliter und entnehmen Sie 20 Mikroliter zum Zählen.

Entsorgen Sie nach der Ziehung den Überstand und legen Sie das Pellet auf Eis. Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS mit EDTA und BSA. Fügen Sie CD117-Mikrokügelchen zur Zellsuspension hinzu und wirbeln Sie sie zum Mischen ein. Danach inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Bringen Sie dann das Volumen auf 10 Milliliter mit mehr PBS mit EDTA und BSA und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1.200 G bei 4 Grad Celsius.

Verwenden Sie das Vakuum, um den Überstand zu entfernen, und suspendieren Sie das Zellpellet in PBS mit EDTA und BSA. Geben Sie dann drei Milliliter PBS mit EDTA und BSA auf ein Magnetstativ mit Magnetsäule und lassen Sie es in ein Sammelröhrchen fließen. Nachdem der Puffer fertig durch die Säule geflossen ist, fügen Sie die Zellsuspension hinzu und lassen Sie sie durch die Säule in das Sammelröhrchen fließen.

Geben Sie anschließend 5 weitere Milliliter PBS mit EDTA und BSA in die Säule und spülen Sie sie sofort mit dem Kolben. Entfernen Sie den Kolben und wiederholen Sie die Spülung, bevor Sie die Zellen zählen. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren der Zellen den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem IMDM für die Kultur. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.