Name: Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die Mikrodissektion von Zebrafisch-Retina mit und ohne retinalem Pigmentepithel für Entwicklungsbiologie und Neuroforschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Gewebe-spezifischer RNA-Expression.

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Diese Arbeit wird durch ein Start-up Fund aus dem Department of Biological Sciences an der Purdue University unterstützt.

Teil 1: Vorbereitungen vor Mikrodissektion <ol><li> Lösungen <ol class="lalpha"><li> E3 Medium 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 und 0,33 mM MgSO 4). </li><li> Ringer-Lösung 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2), sterilfiltriert. </li><li> 5N NaOH. </li></ol></li><li> Chemisches Ätzen von Wolfram Nadeln <ol class="lalpha"><li> Sichern Sie sich einen kleinen Becher mit 5N NaOH auf einer Petrischale mit Ton. </li><li> Bringen Sie eine Büroklammer auf der Seite des Bechers, so dass es in Kontakt mit der NaOH-Lösung kommt. </li><li> Verbinden Sie die negative Elektrode aus einer DC-Stromversorgung, die Büroklammer und die positive Elektrode an einem Ende ein kurzes Stück (~ 2cm) aus Wolframdraht. </li><li> Wickeln Sie das andere Ende des Wolfram-Draht mit einem kleinen Ton-Ball und dip diesem Zweck in die NaOH-Lösung. </li><li> Erhöhen Sie die Spannung auf ca. 3V und tauchen den Draht nach oben und unten in der NaOH-Lösung, bis eine gute Ätzrate erreicht ist. Eine Nadel in guter Qualität können in der Regel in 10 Minuten geätzt werden. </li><li> Der Wolframdraht der Lösung ausgesetzt wird allmählich dünner. Wenn der Ton Kugel abfällt, wird die andere Seite der Leitung, die noch auf der positiven Elektrode angebracht haben eine spitze Nadel Form. </li><li> Spülen Sie die spitze Nadel mit Ringer-Lösung oder E3 zu Salzablagerungen zu entfernen. </li><li> Befestigen Sie die Nadel zu einem Holzstab durch Band oder einen Nadelhalter für eine einfache Handhabung. </li></ol></li><li> Kultur-Platten <ol class="lalpha"><li> Die Falcon 60 x 15 mm Polystyrol Kultur Platten sind bereit, für Netzhaut-Mikrodissektion verwendet werden. </li><li> Für Sezieren RPE-attached Netzhaut, crush zwei Embryonen völlig in einer Kultur Platte mit Ringer-Lösung, um loszuwerden, die Haftfähigkeit der Oberfläche 30 Minuten vor dem Sezieren. Kurz vor ihrer Zerlegung, waschen Sie die Platte intensiv mit frischer Ringerlösung. </li></ol></li><li> Embryonen Sammlung und Inszenierung <ol class="lalpha"><li> Adult Zebrafisch erhalten bleiben, wie beschrieben 4, 5. </li><li> Trennen Sie die Eltern Fisch in statischen Zuchtbecken durch einen Teiler paarweise in der Nacht zuvor Zucht. </li><li> Entfernen Sie die Trennlinie nach dem Raumlicht eingeschaltet ist am nächsten Morgen geworden. Lassen Sie die Eltern, um im 10-Minuten-Takt Cross jede halbe Stunde. Trennen Sie die Fische nach jeder Kreuzung. </li><li> Pflegen Sie die Embryonen aus jeder Kreuzung in E3 Medium getrennt gesammelt bei 28 ° C. </li><li> Embryonen bei 10 bis 12 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und reinszenieren unmittelbar vor Dissektion an der bestimmten Zeitpunkten, nach festgelegten Kriterien 1, 6. </li></ol></li></ol> Teil 2: Dissection - Gehirn entfernt und Auge Belichtung 1 <ul><li> Die Verfahren in diesem Abschnitt beschrieben sind häufig zum Präparieren Netzhaut (Teil 3A) und RPE-attached Netzhaut (3b). </li><li> Alle feinen Sektionen werden von einer Spitze des Dumont Pinzetten getan und unterstützt durch ein anderes Paar von Dumont Pinzetten zur Positionierung des Gewebes. Ein chemisch geätzten Wolframnadel kann für eine feinere Manipulationen bei Bedarf verwendet werden. </li><li> Alle feinen Dissektionen sind bei ~ 5-8fache Vergrößerung unter einem SZX16 Mikroskop mit einem 1X Ziel oder gleichwertig ausgestattet war. </li><li> Pflegen Sie die Embryonen in E3-Medium in einem Tischgerät Brutschrank bei 28 ° C neben dem Mikroskop leicht Embryo Zugang beim Präparieren. </li><li> Der Mikroskoptisch ist bis 28 ° C durch eine thermo Platte erwärmt, um den Einfluss von Temperaturschwankungen auf die Genexpression zu minimieren. </li></ul><ol><li> Transfer eines Embryos zu einem bestimmten Entwicklungsstadium an Ringer-Lösung in einem Falcon 60 X 15 mm Kulturplatte hergestellt, wie in Teil 1 # 3 beschrieben. </li><li> Schneiden Sie den Kopf mit einem Teil der vorderen Kofferraum schnell aus dem Körper. </li><li> Pin das hintere Ende dieses Gewebes auf die Kultur Platte mit der Unterstützung der Pinzette. </li><li> Öffnen Sie den Kopf auf der Rückenseite ab der vorderen Stirn. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn, so dass die mediale Seite der Augen ausgesetzt ist und nach oben gerichtet ist für weitere Manipulationen. </li></ol> Teil 3a: Retinal Dissektion 1 <ol><li> Bereiten Sie den Embryo als in Teil 2 beschrieben. </li><li> Gründlich abbürsten der exponierten RPE auf der medialen Seite des Augapfels, die nach oben durch die Spitze der Zange, bis eine kleine Öffnung auf der Netzhaut zu sehen ist. </li><li> Setzen Sie die Bürsten und Peeling Aktion bis der medialen Seite der Netzhaut fast alle ausgesetzt sind. Vermeiden Sie Kratzer und Stanzen der exponierten Netzhaut. </li><li> Um die seitliche RPE auf der Netzhaut, die nun vor nach unten, Ansatz entfernen, und Bürste in einem Winkel von ca. 45 ° von der Kultur Plattenoberfläche. </li><li> Entfernen Sie das RPE, die relativ fest an der ora serrata befestigt durch Pinning der abgelösten Teil des RPE, die culture Platte für die Präparation und heben Sie dann die Netzhaut sanft. </li><li> Rolle der Netzhaut auf dem Boden der Kulturschale zu bereinigen die restliche RPE. <ol class="lalpha"><li> Wir haben bemerkt, dass diese besondere Falcon Polystyrol Kulturplatte Vorzugspreis Einhaltung der RPE für ca. 20 Minuten einmal ein Embryo ist gebrochen. Diese Eigenschaft ist für die Entfernung von RPE Reste eingesetzt. Allerdings sind die Zellen der Netzhaut-Stick an die Oberfläche zu einem geringeren Teil, die eng unter hoher Vergrößerung untersucht werden. Man muss ein Gleichgewicht zwischen der Vollständigkeit der RPE Entfernung und Retina Integrität zu schlagen. </li><li> Das Objektiv oft hält sich an die Kultur Platte und löst sich von der Netzhaut beim Walzen. Gelegentlich ist es notwendig, die Linse durch eine geätzte Wolframnadel lösen mit einem wirbelnden Wirkung auf die Oberfläche der Linse. </li></ol></li><li> Diese Verfahren können erfolgreich beseitigt RPE von der Netzhaut, ohne dabei die Integrität des Gewebes. Dies wird durch eine insgesamt gute Morphologie (Abbildung 1B und B ') und Histologie (Abbildung 1B ") angegeben, Pfeil Insbesondere die Erhaltung der extrazellulären Matrix zwischen den Photorezeptor-Schicht und der RPE außergewöhnlich gut ist (Abbildung 1B." Vergleich mit der Histologie aus der ganzen Embryo (Abbildung 1A ")). </li></ol> Teil 3b: RPE-attached Netzhaut Dissektion 3 <ol><li> Bereiten Sie den Embryo als in Teil 2 beschrieben. </li><li> Pin den Kopf, um die Kultur Platte vom Assistenten Pinzette. Heben Sie das Auge vorsichtig aus dem hinteren lateralen Seite und rollen auf der Vorderseite. <ol class="lalpha"><li> Die mutmaßlichen Aderhaut und Skleralgewebe auf der Außenseite des RPE Schicht relativ dicht an der Haut befestigt und kann meist abgezogen werden durch Rollen der Augen sorgfältig auf die Vorderseite. </li></ol></li><li> Nehmen Sie das Objektiv mit einer Wolfram-Nadel nach der lateralen Seite des Auges ausgesetzt ist, und wenn das Auge ist immer noch auf der Haut angebracht. </li><li> Diese Verfahren können mit Erfolg in der ganzen RPE-Schicht mit der Netzhaut. Mutmaßlich Choroidea und Skleralgewebe weitgehend entfernt werden (Abbildung 1C, C 'und C "). </li></ol> Teil 4: Tissue Probenentnahme für die RNA-Arbeiten <ol><li> Die seziert Proben können in TRIzol in ein RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen für nachgeschaltete RNA Charakterisierung als vor 1 beschrieben gesammelt werden. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) Laterale und (A ') Dorsalansicht eines Zebrafisch-Larven Kopf bei 52 hpf vor ihrer Zerlegung. (A ") die entsprechenden histologischen Schnitt der larvalen Kopf in (A) &amp; (A '). (B) Laterale und (B') Dorsalansicht eines seziert Netzhaut bei 54 hpf. Die Oberfläche der Netzhaut intakt war von beiden seitlichen und dorsalen Aussicht. (B ") die entsprechenden histologischen Schnitt des seziert Netzhaut in (B) und (B '). Die Struktur der Netzhaut und des retinalen Laminierung war intakt. Insbesondere die extrazelluläre Matrix zwischen den Photorezeptorschicht und RPE (A "(, Pfeile war, Pfeile) sowie in den sezierten Netzhaut B) erhalten." (C) Quer-und (C ') medialen Darstellung eines seziert RPE-attached Netzhaut bei 52 hpf. RPE-Schicht intakt war und kontinuierliche, was auch durch die histologischen Schnitt des sezierten Gewebes (C ") angegeben. Der weiße Bereich in C 'ist der Sehnerv (Pfeil). Für Histologie, Gewebeproben gesammelt und in 4% Paraformaldehyd. Plastic Einbettung und Schneiden dieser Proben wurden wie 3 beschrieben. Scale-bar = 50 pm.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Purdue Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt.

Mikrodissektion von Zebrafisch Augengewebe effektiv erhalten intakte Netzhaut und RPE-attached Netzhaut. Diese im Wesentlichen unterstützt Ausdruck Studien in Bezug auf ein bestimmtes Augengewebes (dh Netzhaut oder RPE). In der Tat haben wir erfolgreich diese Verfahren genutzt werden, um RNA Expressionsprofile der ganze Netzhaut 1 und RPE 3 zu erhalten. Der Nutzen dieser Profile ist stark von unserer letzten Identifizierung von Wegen und Gen-Familien, die in einem Retina-Differenzierung mutierten <...

<table><tbody><tr><td>Kabelloser Stößelmotor</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Gleichstromquelle</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Jede Gleichstromquelle würde funktionieren. Die spezifische Spannung einer anderen Maschine erfordert eine weitere Optimierung.</td></tr><tr><td>Einwegzerkleinerungsstab &amp;& Mikroröhrchen, 1,5 mL (DNase-, RNase- und pyrogenfrei)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>Diese werden zur Gewebesammlung in TRIzol für die Expressionsanalyse verwendet.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette, Spitzen: 0,05 x 0,01 mm, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>Eine feine Nadelspitze ist wünschenswert, jedoch nicht zwingend erforderlich, da die Spitze gelegentlich nachgeschliffen werden muss.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzette, Spitzen: 0,025 × 0,005 mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Feine Spitzenabmessungen sind wünschenswert, jedoch nicht zwingend, da die Spitze gelegentlich nachgeschliffen werden muss.</td></tr><tr><td>Falcon-Polystyrol-Kulturplatten, 60 × 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Diese Platten werden als Präparationsplatten verwendet.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 Stereomikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Jedes Stereomikroskop ist geeignet. In früheren Studien verwendeten wir ein Leica-Stereomikroskop.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; ohne Probleme. Wir verwenden das 1X-Objektiv ausschließlich für die Dissektion, obwohl ein 2X-Objektiv installiert ist. </td></tr><tr><td>Schleifstein</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>Verwenden Sie dies, um die Spitze der Pinzette gegebenenfalls zu schärfen</td></tr><tr><td>Thermoplate</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Dies dient dazu, die Temperatur des Gewebes während der Dissektion konstant zu halten und den Einfluss von Temperaturschwankungen auf die Genexpression zu minimieren. Außerdem stellen wir das gesamte Mikroskop in einen klimatisierten Raum mit einer Temperatur von 28 °C.&amp;#x00B0;C während der Dissektion in früheren Studien&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; mit gutem Erfolg</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Wolframdraht, 0,015 Zoll Durchmesser</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Holzspatel</td><td>Puritan</td><td>807</td><td>Dies dient zum Halten der chemisch geätzten Wolframnadel.</td></tr></tbody></table>

mikrodissektion von zebrafisch embryonale augentücher

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafisch ist ein beliebter Tiermodell zur Erforschung der Entwicklung des Auges wegen seiner schnellen<em&gt; Ex utero</em&gt; Entwicklung und gute Fruchtbarkeit. Von 3 Tagen nach der Befruchtung (DPF), werden die Larven zeigen die erste visuelle Antwort. Viele Gene sind identifiziert worden, um eine ordnungsgemäße Entwicklung des Auges steuern, aber wir sind weit von einem vollständigen Verständnis der zugrunde liegenden genetischen Architektur. Whole Genome Genexpressions-Profiling ist ein nützliches Werkzeug, um Genregulationsnetzwerk für Entwicklung des Auges zu erläutern. Allerdings macht die geringe Größe des embryonalen Auges in Zebrafisch es schwierig, intakt und rein Augengewebe für die Expression Analyse zu erhalten. Zum Beispiel ist die anterior-posterior Länge des Auges zwischen Tag 2 und 3 nur etwa 200-300 um, während der Durchmesser der Linse ist weniger 100 um. Außerdem ist das retinale Pigmentepithel (RPE) der Netzhaut zugrunde liegende nur ein Single-Layer-Epithel. Während Genexpressionsprofile aus der ganzen Embryos gewonnen werden können, tun sie nicht genau die Expression dieser Gewebe. Deshalb reine Gewebe muss für eine erfolgreiche Genexpressionsanalysen von der Entwicklung des Auges erreicht werden. Um dieses Problem anzugehen, haben wir einen Ansatz zur intakten Netzhaut und der Netzhaut mit RPE 1 bis 3 dpf angebracht, die wichtigsten Stadien der Morphogenese Auge abdecken microdissect entwickelt. Alle Vorgänge können mit feinen Pinzetten und allgemeinen Laborbedarf unter Standard-Stereomikroskope durchgeführt werden. Für Netzhaut Dissektion ist die Single-Layer-RPE entfernt und durch Bürsten Aktion und die bevorzugte Einhaltung der RPE Reste auf der Oberfläche der Kulturplatte für die Präparation geschält. Für RPE-attached Netzhaut Dissektion, ist die Einhaltung von RPE der Dissektion Platte vor der Dissektion entfernt, so dass der RPE vollständig mit der Retina erhalten. Eine sorgfältige Hubwirkung dieses Gewebes können effizient trennen die mutmaßlichen Ader-und Lederhaut. Die Linse kann in beiden Fällen durch eine chemisch geätzt Wolframnadel entfernt werden. Kurz gesagt, unser Ansatz erhalten intakte Auge Gewebe und wurde erfolgreich genutzt, um Gewebe-spezifische Expression Profile der Zebrafisch-Retina-Studie<sup&gt; 1, 2</sup&gt; Und Pigmentepithel<sup&gt; 3</sup&gt;.

Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Zebrafisch Retina mit und ohne Pigmentepithel angebracht, von einem bis drei Tagen der Befruchtung Embryonen microdissect.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner schnellen ex utero Entwicklung und hohen Fruchtbarkeit ein beliebtes Tiermodell für die Forschung zur Augenentwicklung. Bis zu 3 Tage nach ...

Dieses Video zeigt die Mikrodissektion der Netzhaut und der Netzhaut mit angeheftetem retinalem Pigmentepithel (RPE) von Zebrafischembryonen ein bis drei Tage nach der Befruchtung. Alle Verfahren können mit feinen Pinzetten und allgemeinen Laborbedarf durchgeführt werden. Unter standardmäßigen Stereomikroskopen zur Netzhautdissektion wird die einlagige RPE-Schicht durch eine Bürstbewegung entfernt und abgezogen, wobei die RPE durch Adhäsion an der Oberfläche der Kulturplatte abgelöst wird.Für die Dissektion der mit retinalem Pigmentepithel (RPE) verbundenen Netzhaut werden die adhäsiven Eigenschaften der Kulturschale durch embryonales Zerkleinern und anschließendes Waschen vor der Dissektion entfernt. Um das RPE intakt zu erhalten, wird dieses Gewebe vorsichtig angehoben, wodurch Chorioidea und Sklera effizient von der mit der Netzhaut verbundenen RPE-Schicht getrennt werden; anschließend erfolgt die Entfernung der Linse mittels einer chemisch geätzten Wolframnadel. Diese Dissektionsmethode ermöglicht die Gewinnung intakter Netzhautgewebe und wurde erfolgreich zur Untersuchung gewebespezifischer RNA-Expression sowie zur Analyse von Expressionsprofilen in der Zebrafisch-Netzhaut und dem retinalen Pigmentepithel eingesetzt.Hallo, ich bin Li Jang aus dem Labor von Professor UFE Leon am Fachbereich Biowissenschaften der Purdue University. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Augengewebe von Zebrafischembryonen präpariert. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um das Gen-Netzwerk zu untersuchen, das die Augenentwicklung reguliert.Beginnen wir also. Acht. Bereiten Sie vor der Mikrodissektion die folgenden Lösungen zu: E drei, mittleres, filtersterilisiertes Ringer-Lösung und fünf normale Natronlauge.Als Nächstes chemisch Ätzen von Wolframnadeln. Stellen Sie ein kleines Becherglas mithilfe von Ton in eine Petrischale, um das Handhaben des Glases zu erleichtern und ein Verschütten von Natriumhydroxid zu verhindern. Befestigen Sie einen handelsüblichen Büroklammerbügel an der Seite des Becherglases.Geben Sie fünf normales Natriumhydroxid in das Becherglas, bis der Clip das Natriumhydroxid berührt. Verbinden Sie die negative Elektrode einer Gleichstromquelle mit dem Büroklammerbügel und die positive Elektrode mit einem Ende eines kurzen Wolframdrahtstücks. Wickeln Sie das andere Ende des Wolframdrahts mit einer tonartigen Kugel mit vier Millimeter Durchmesser um und tauchen Sie dieses Ende in die Natriumhydroxidlösung ein.Erhöhen Sie die Spannung auf etwa drei Volt und tauchen Sie den Draht für ungefähr 10 Minuten im Abstand von einer Sekunde wiederholt in die Natriumhydroxidlösung ein. Der Wolframdraht, der der Natriumhydroxidlösung ausgesetzt ist, wird allmählich dünner, und sobald die Tonkugel von der anderen Seite des Drahtes abfällt, der mit der positiven Elektrode verbunden ist, weist dieser eine scharfe nadelförmige Struktur auf. Spülen Sie die scharfe Nadel mit Ringer-Lösung oder E3, um Salzablagerungen zu entfernen, und befestigen Sie die Nadel mithilfe von Klebeband oder einer Nadelhalterung an einem Holzspatel, um die Handhabung zu erleichtern, um Embryonen für die Dissektion vorzubereiten.Halten Sie adulte Superfische gemäß Standardprotokollen am Abend vor der Zucht. Trennen Sie die Elternfische paarweise in statischen Zuchtbecken mit einem Trenner. Entfernen Sie den Trenner, nachdem am nächsten Morgen das Raumlicht eingeschaltet wurde, und lassen Sie die Eltern alle halbe Stunde im Abstand von jeweils 10 Minuten paaren, wobei die Fische nach jedem Paarungsvorgang wieder getrennt werden.Die aus jedem Kreuzungsansatz gewonnenen Embryonen separat in E3-Medium bei 28 Grad Celsius kultivieren. Die Embryonen 10 bis 12 Stunden nach der Befruchtung einteilen und unmittelbar vor der Dissektion zu den jeweiligen Zeitpunkten erneut einteilen. Zur Dissektion Falcon-Kulturplatten aus Polystyrol mit den Maßen 60 × 15 Millimeter verwenden.Eine neue, unbenutzte Platte weist eine intrinsische Adhäsivität für RPE-Gewebe von etwa 20 Minuten auf und kann bei der Entfernung des RPE für Netzhautpräparationen hilfreich sein. Falls eine RPE-angeheftete Retina gewünscht ist, kann diese Adhäsivität überwunden werden, indem zwei Embryonen vollständig in einer Kulturplatte mit Ringer-Lösung zerkleinert und vor der Präparation 30 Minuten lang stehengelassen werden, gefolgt von einer ausgiebigen Wäsche mit frischer Ringer-Lösung vor der Präparation. Alle feinen Präparationen werden mit einer Vergrößerung von etwa fünf- bis achtfach an einem Olympus SC X 16-Mikroskop mit einem 1x-Objektiv durchgeführt.Unter Verwendung von Dumont-Forceps oder einer chemisch geätzten Wolframnadel wird der Mikroskoptisch auf 28 Grad Celsius erwärmt. Um den Einfluss von Temperaturschwankungen beim Beginn der Netzhaut-Dissektion zu minimieren, überführen Sie ein Embryo eines bestimmten Entwicklungsstadiums in fünf Milliliter Ringer-Lösung in einer Falcon-60-mal-15-Millimeter-Kulturplatte, die wie für die Netzhaut-Dissektion ohne RRPE beschrieben vorbereitet wurde, schneiden Sie den Kopf und einen Teil des vorderen Rumpfes mit der scharfen Spitze des Forceps ab, entfernen Sie schnell den Zebrafischkörper und befestigen Sie danach das hintere Ende des Kopf-Rumpf-Abschnitts auf der Kulturplatte. Öffnen Sie mit Hilfe des Hilfs-Forceps den Kopf von der vorderen Stirn ausgehend an der dorsalen Seite.Entfernen Sie das Gehirn, sodass die mediale Seite der Augen freigelegt ist und nach oben zeigt, um weitere Manipulationen durchzuführen. Um die Netzhaut zu präparieren, verwenden Sie die Spitze der Pinzette, um vorsichtig die freigelegte retinale Pigmentepithelschicht (RPE) auf der nach oben zeigenden medialen Seite des Auges zu bearbeiten, bis eine kleine Öffnung zur Netzhaut sichtbar wird. Setzen Sie das vorsichtige Abstreichen und Abheben fort, bis die mediale Seite der Netzhaut fast vollständig freigelegt ist.Vermeiden Sie es, die freiliegende Netzhaut zu ritzen oder zu durchstechen, um das seitliche Pigmentepithel (RPE) auf der Netzhaut der Augenseite, die der Kulturschale zugewandt ist, zu entfernen. Halten Sie dabei einen Winkel von etwa 45 Grad zur Oberfläche der Kulturschale und streichen Sie mit der Pinzette vorsichtig über das Auge. Entfernen Sie das Pigmentepithel, das relativ fest an der Ora serrata haftet, indem Sie den abgelösten Teil des Pigmentepithels mit der Pinzette an der Kulturschale fixieren, um die Dissektion durchzuführen.Heben Sie dann die Netzhaut vorsichtig an, um das verbleibende retinale Pigmentepithel zu entfernen, und lösen Sie die Linse unter Nutzung der Haftungseigenschaften der Kulturschale. Achten Sie darauf, die Netzhautzellen nicht zu beschädigen, die ebenfalls leicht an der Oberfläche der Schale haften. Falls sich die Linse nicht durch Rollbewegungen löst, verwenden Sie eine gravierte Wolframenadel mit kreisenden Bewegungen auf der Linsenoberfläche.Um die RPE-verbundene Netzhautdissektion zu beginnen, verwenden Sie eine Falcon-60-mal-15-Millimeter-Kulturplatte, die wie für eine RPE-verbundene Netzhautdissektion beschrieben vorbereitet wurde. Überführen Sie ein Embryo eines bestimmten Entwicklungsstadiums in fünf Milliliter Ringer-Lösung. Schneiden Sie den Kopf und einen Teil des vorderen Rumpfes ab.Entfernen Sie schnell den Zebrafischkörper, wie zuvor beschrieben. Befestigen Sie das hintere Ende des Kopf-Rumpf-Abschnitts auf einer Kulturplatte. Öffnen Sie mit Hilfe der Pinzette den Kopf an der dorsalen Seite, beginnend an der vorderen Stirn.Entfernen Sie das Gehirn, sodass die mediale Seite der Augen freigelegt ist und nach oben zeigt. Heben Sie das Auge für weitere Manipulationen mit der Pinzette vorsichtig von der hinteren lateralen Seite an und rollen Sie es zur vorderen Seite. Die Chorioidea und das sklerale Gewebe auf der Außenseite der RPE-Schicht sind relativ fest mit der Haut verbunden und können größtenteils abgelöst werden, indem das Auge sorgfältig zur vorderen Seite gerollt wird.Entfernen Sie die Linse mit der Wolframnadel, nachdem die seitliche Seite des Auges freigelegt wurde und solange das Auge noch mit der Haut verbunden ist, um die Netzhaut zu dissekieren. Ohne Pigmentepithel und mit Pigmentepithel verbundene Netzhaut können die präparierten Proben in Triol in einem RNAse-freien Mikroröhrchen für die nachfolgende RNA-Charakterisierung gesammelt werden.Hier ist eine erfolgreiche Netzhaut-Dissektion ohne Pigmentepithel (RPE) dargestellt, bei der die Netzhautintegrität erhalten bleibt, wie durch die intakte Netzhautoberfläche angezeigt. Der entsprechende histologische Schnitt zeigt ebenfalls, dass die Netzhautarchitektur sehr gut erhalten ist. Insbesondere die Erhaltung der extrazellulären Matrix zwischen der Photorezeptorschicht und dem RPE ist außergewöhnlich gut.Eine erfolgreiche RPE-verbundene Netzhautdissektion zeigt sich durch eine intakte und zusammenhängende RPE-Schicht. Der entsprechende histologische Schnitt zeigt, dass sowohl Netzhaut- als auch RPE-Zellen in gutem Zustand sind. Die aus den dissezierten Netzhäuten extrahierte Gesamt-RNA ist von hoher Qualität. Dies zeigt sich im Elektropherogramm und im Gelbild, die aus der Bioanalyzer-Analyse stammen. Die Basislinie ist flach und die ribosomalen Peaks der 18 s und 28 s sind intakt. Die RNA-Integritätszahl liegt typischerweise über 9,8.Wir haben Ihnen soeben die Mikrodissektionsverfahren zur Gewinnung der embryonalen Netzhaut von Zebrafischen mit und ohne retinalem Pigmentepithel (RPE) gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die entscheidenden Schritte bei der Netzhautdissektion die Bürstbewegung mit der Spitze der Pinzette und das Rollen des Gewebes sind. Für die Entfernung von RPE-Resten haben wir festgestellt, dass das Abstützen der Ellbogen auf einer verstellbaren Armlehne des Stuhls während der Dissektion die Handbewegungen erheblich stabilisieren kann.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Objektiv Entwicklung beinhaltet Wechselwirkungen mit anderen Geweben. Mehrere Zebrafisch Auge Mutanten sind durch eine abnormal kleine Linse Größe aus. Hier zeigen wir eine Linse Transplantation experimentieren, um festzustellen, ob dieser Phänotyp durch inneren Ursachen oder defekte Interaktion mit Gewebe, die das Objektiv umgeben ist.

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

Dieses Video beschreibt das Protokoll, das entwickelt wurde, um adulte und larvale Zebrafischlinsen zu präparieren, um die kortikale Linsenmorphologie und strukturelle Integrität der Linsennähte zu analysieren.

Dissektion von Augenlinsen: Eine Technik zur Beobachtung der Morphologie von Zebrafischlinsen

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Abbildung der Embryonalentwicklung. Es ermöglicht die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Wir demonstrieren seine Anwendung für die Bildgebung der Entwicklung von Zebrafischaugen über weite räumliche und zeitliche Skalen und stellen eine Pipeline für die Fusion und Dekonvolution von Multiview-Datensätzen vor.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Hier diskutieren wir eine Methode-Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in Einstellungen des langfristigen vaskuläre Krankheiten Neoangiogenese und strukturelle Veränderungen verbunden.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von...

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Lernen Sie die Mikrodissektion von Zebrafisch-Retina mit und ohne retinalem Pigmentepithel für Entwicklungsbiologie und Neuroforschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Gewebe-spezifischer RNA-Expression.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

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