Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Dieses Video zeigt die Mikrodissektion der Netzhaut und der Netzhaut mit angeheftetem retinalem Pigmentepithel (RPE) von Zebrafischembryonen ein bis drei Tage nach der Befruchtung. Alle Verfahren können mit feinen Pinzetten und allgemeinen Laborbedarf durchgeführt werden. Unter standardmäßigen Stereomikroskopen zur Netzhautdissektion wird die einlagige RPE-Schicht durch eine Bürstbewegung entfernt und abgezogen, wobei die RPE durch Adhäsion an der Oberfläche der Kulturplatte abgelöst wird.

Für die Dissektion der mit retinalem Pigmentepithel (RPE) verbundenen Netzhaut werden die adhäsiven Eigenschaften der Kulturschale durch embryonales Zerkleinern und anschließendes Waschen vor der Dissektion entfernt. Um das RPE intakt zu erhalten, wird dieses Gewebe vorsichtig angehoben, wodurch Chorioidea und Sklera effizient von der mit der Netzhaut verbundenen RPE-Schicht getrennt werden; anschließend erfolgt die Entfernung der Linse mittels einer chemisch geätzten Wolframnadel. Diese Dissektionsmethode ermöglicht die Gewinnung intakter Netzhautgewebe und wurde erfolgreich zur Untersuchung gewebespezifischer RNA-Expression sowie zur Analyse von Expressionsprofilen in der Zebrafisch-Netzhaut und dem retinalen Pigmentepithel eingesetzt.

Hallo, ich bin Li Jang aus dem Labor von Professor UFE Leon am Fachbereich Biowissenschaften der Purdue University. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Augengewebe von Zebrafischembryonen präpariert. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um das Gen-Netzwerk zu untersuchen, das die Augenentwicklung reguliert.

Beginnen wir also. Acht. Bereiten Sie vor der Mikrodissektion die folgenden Lösungen zu: E drei, mittleres, filtersterilisiertes Ringer-Lösung und fünf normale Natronlauge.

Als Nächstes chemisch Ätzen von Wolframnadeln. Stellen Sie ein kleines Becherglas mithilfe von Ton in eine Petrischale, um das Handhaben des Glases zu erleichtern und ein Verschütten von Natriumhydroxid zu verhindern. Befestigen Sie einen handelsüblichen Büroklammerbügel an der Seite des Becherglases.

Geben Sie fünf normales Natriumhydroxid in das Becherglas, bis der Clip das Natriumhydroxid berührt. Verbinden Sie die negative Elektrode einer Gleichstromquelle mit dem Büroklammerbügel und die positive Elektrode mit einem Ende eines kurzen Wolframdrahtstücks. Wickeln Sie das andere Ende des Wolframdrahts mit einer tonartigen Kugel mit vier Millimeter Durchmesser um und tauchen Sie dieses Ende in die Natriumhydroxidlösung ein.

Erhöhen Sie die Spannung auf etwa drei Volt und tauchen Sie den Draht für ungefähr 10 Minuten im Abstand von einer Sekunde wiederholt in die Natriumhydroxidlösung ein. Der Wolframdraht, der der Natriumhydroxidlösung ausgesetzt ist, wird allmählich dünner, und sobald die Tonkugel von der anderen Seite des Drahtes abfällt, der mit der positiven Elektrode verbunden ist, weist dieser eine scharfe nadelförmige Struktur auf. Spülen Sie die scharfe Nadel mit Ringer-Lösung oder E3, um Salzablagerungen zu entfernen, und befestigen Sie die Nadel mithilfe von Klebeband oder einer Nadelhalterung an einem Holzspatel, um die Handhabung zu erleichtern, um Embryonen für die Dissektion vorzubereiten.

Halten Sie adulte Superfische gemäß Standardprotokollen am Abend vor der Zucht. Trennen Sie die Elternfische paarweise in statischen Zuchtbecken mit einem Trenner. Entfernen Sie den Trenner, nachdem am nächsten Morgen das Raumlicht eingeschaltet wurde, und lassen Sie die Eltern alle halbe Stunde im Abstand von jeweils 10 Minuten paaren, wobei die Fische nach jedem Paarungsvorgang wieder getrennt werden.

Die aus jedem Kreuzungsansatz gewonnenen Embryonen separat in E3-Medium bei 28 Grad Celsius kultivieren. Die Embryonen 10 bis 12 Stunden nach der Befruchtung einteilen und unmittelbar vor der Dissektion zu den jeweiligen Zeitpunkten erneut einteilen. Zur Dissektion Falcon-Kulturplatten aus Polystyrol mit den Maßen 60 × 15 Millimeter verwenden.

Eine neue, unbenutzte Platte weist eine intrinsische Adhäsivität für RPE-Gewebe von etwa 20 Minuten auf und kann bei der Entfernung des RPE für Netzhautpräparationen hilfreich sein. Falls eine RPE-angeheftete Retina gewünscht ist, kann diese Adhäsivität überwunden werden, indem zwei Embryonen vollständig in einer Kulturplatte mit Ringer-Lösung zerkleinert und vor der Präparation 30 Minuten lang stehengelassen werden, gefolgt von einer ausgiebigen Wäsche mit frischer Ringer-Lösung vor der Präparation. Alle feinen Präparationen werden mit einer Vergrößerung von etwa fünf- bis achtfach an einem Olympus SC X 16-Mikroskop mit einem 1x-Objektiv durchgeführt.

Unter Verwendung von Dumont-Forceps oder einer chemisch geätzten Wolframnadel wird der Mikroskoptisch auf 28 Grad Celsius erwärmt. Um den Einfluss von Temperaturschwankungen beim Beginn der Netzhaut-Dissektion zu minimieren, überführen Sie ein Embryo eines bestimmten Entwicklungsstadiums in fünf Milliliter Ringer-Lösung in einer Falcon-60-mal-15-Millimeter-Kulturplatte, die wie für die Netzhaut-Dissektion ohne RRPE beschrieben vorbereitet wurde, schneiden Sie den Kopf und einen Teil des vorderen Rumpfes mit der scharfen Spitze des Forceps ab, entfernen Sie schnell den Zebrafischkörper und befestigen Sie danach das hintere Ende des Kopf-Rumpf-Abschnitts auf der Kulturplatte. Öffnen Sie mit Hilfe des Hilfs-Forceps den Kopf von der vorderen Stirn ausgehend an der dorsalen Seite.

Entfernen Sie das Gehirn, sodass die mediale Seite der Augen freigelegt ist und nach oben zeigt, um weitere Manipulationen durchzuführen. Um die Netzhaut zu präparieren, verwenden Sie die Spitze der Pinzette, um vorsichtig die freigelegte retinale Pigmentepithelschicht (RPE) auf der nach oben zeigenden medialen Seite des Auges zu bearbeiten, bis eine kleine Öffnung zur Netzhaut sichtbar wird. Setzen Sie das vorsichtige Abstreichen und Abheben fort, bis die mediale Seite der Netzhaut fast vollständig freigelegt ist.

Vermeiden Sie es, die freiliegende Netzhaut zu ritzen oder zu durchstechen, um das seitliche Pigmentepithel (RPE) auf der Netzhaut der Augenseite, die der Kulturschale zugewandt ist, zu entfernen. Halten Sie dabei einen Winkel von etwa 45 Grad zur Oberfläche der Kulturschale und streichen Sie mit der Pinzette vorsichtig über das Auge. Entfernen Sie das Pigmentepithel, das relativ fest an der Ora serrata haftet, indem Sie den abgelösten Teil des Pigmentepithels mit der Pinzette an der Kulturschale fixieren, um die Dissektion durchzuführen.

Heben Sie dann die Netzhaut vorsichtig an, um das verbleibende retinale Pigmentepithel zu entfernen, und lösen Sie die Linse unter Nutzung der Haftungseigenschaften der Kulturschale. Achten Sie darauf, die Netzhautzellen nicht zu beschädigen, die ebenfalls leicht an der Oberfläche der Schale haften. Falls sich die Linse nicht durch Rollbewegungen löst, verwenden Sie eine gravierte Wolframenadel mit kreisenden Bewegungen auf der Linsenoberfläche.

Um die RPE-verbundene Netzhautdissektion zu beginnen, verwenden Sie eine Falcon-60-mal-15-Millimeter-Kulturplatte, die wie für eine RPE-verbundene Netzhautdissektion beschrieben vorbereitet wurde. Überführen Sie ein Embryo eines bestimmten Entwicklungsstadiums in fünf Milliliter Ringer-Lösung. Schneiden Sie den Kopf und einen Teil des vorderen Rumpfes ab.

Entfernen Sie schnell den Zebrafischkörper, wie zuvor beschrieben. Befestigen Sie das hintere Ende des Kopf-Rumpf-Abschnitts auf einer Kulturplatte. Öffnen Sie mit Hilfe der Pinzette den Kopf an der dorsalen Seite, beginnend an der vorderen Stirn.

Entfernen Sie das Gehirn, sodass die mediale Seite der Augen freigelegt ist und nach oben zeigt. Heben Sie das Auge für weitere Manipulationen mit der Pinzette vorsichtig von der hinteren lateralen Seite an und rollen Sie es zur vorderen Seite. Die Chorioidea und das sklerale Gewebe auf der Außenseite der RPE-Schicht sind relativ fest mit der Haut verbunden und können größtenteils abgelöst werden, indem das Auge sorgfältig zur vorderen Seite gerollt wird.

Entfernen Sie die Linse mit der Wolframnadel, nachdem die seitliche Seite des Auges freigelegt wurde und solange das Auge noch mit der Haut verbunden ist, um die Netzhaut zu dissekieren. Ohne Pigmentepithel und mit Pigmentepithel verbundene Netzhaut können die präparierten Proben in Triol in einem RNAse-freien Mikroröhrchen für die nachfolgende RNA-Charakterisierung gesammelt werden.

Hier ist eine erfolgreiche Netzhaut-Dissektion ohne Pigmentepithel (RPE) dargestellt, bei der die Netzhautintegrität erhalten bleibt, wie durch die intakte Netzhautoberfläche angezeigt. Der entsprechende histologische Schnitt zeigt ebenfalls, dass die Netzhautarchitektur sehr gut erhalten ist. Insbesondere die Erhaltung der extrazellulären Matrix zwischen der Photorezeptorschicht und dem RPE ist außergewöhnlich gut.

Eine erfolgreiche RPE-verbundene Netzhautdissektion zeigt sich durch eine intakte und zusammenhängende RPE-Schicht. Der entsprechende histologische Schnitt zeigt, dass sowohl Netzhaut- als auch RPE-Zellen in gutem Zustand sind. Die aus den dissezierten Netzhäuten extrahierte Gesamt-RNA ist von hoher Qualität.

Dies zeigt sich im Elektropherogramm und im Gelbild, die aus der Bioanalyzer-Analyse stammen. Die Basislinie ist flach und die ribosomalen Peaks der 18 s und 28 s sind intakt. Die RNA-Integritätszahl liegt typischerweise über 9,8.

Wir haben Ihnen soeben die Mikrodissektionsverfahren zur Gewinnung der embryonalen Netzhaut von Zebrafischen mit und ohne retinalem Pigmentepithel (RPE) gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die entscheidenden Schritte bei der Netzhautdissektion die Bürstbewegung mit der Spitze der Pinzette und das Rollen des Gewebes sind. Für die Entfernung von RPE-Resten haben wir festgestellt, dass das Abstützen der Ellbogen auf einer verstellbaren Armlehne des Stuhls während der Dissektion die Handbewegungen erheblich stabilisieren kann.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.