JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 5:11 Min. • April 30th, 2023
- Organoide sind winzige, dreidimensionale Zellkulturen, die aus gewebespezifischen Stammzellen gewonnen werden. Sie sind genomisch stabil, aber durch Transfektion genetisch veränderbar und damit ideal für genetische Untersuchungen. Für die Transfektion werden die Organoide in eine Multiwell-Kulturplatte mit einem spezifischen Nährmedium gesät und für die gewünschte Dauer inkubiert. Geben Sie als Nächstes eine Dissoziationsmischung auf die Platte, um die Dissoziation der Organoidzellen zu unterstützen. Die Mischung in ein Röhrchen geben und zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Organoid-Pellet in einem Elektroporationspuffer, der fluoreszenzmarkierte Plasmid-DNA enthält. Der Puffer stabilisiert die Zellen und verhindert den Zelltod durch elektrischen Stress.
Füllen Sie die Mischung in eine Küvette und elektropolieren Sie die Zellen. Elektrische Impulse durch die Zellmembran führen zu einer vorübergehenden Porenbildung, um die Aufnahme von Plasmid-DNA in die Zelle zu erleichtern. Nach der Elektroporation sofort Kulturmedium in die Zellsuspension geben und das Gemisch in ein Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie nun die Zellen. Resuspendieren Sie das Pellet in der Kellermatrix und geben Sie es zur Polymerisation auf die Multiwell-Platte. Legen Sie die Platte unter ein Fluoreszenzmikroskop und prüfen Sie die Zellen auf Fluoreszenz, was eine effiziente Transfektion bestätigt. Im folgenden Protokoll führen wir eine Elektroporation durch, um gastrointestinale Organoide zu transfizieren.
- Beginnen Sie mit dem Vorwärmen von 48-Well-Platten bei 37 Grad Celsius für die Aussaat nach der Elektroporation und bereiten Sie dann Basal- und Organoidkultur-spezifische Medien gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor. Kultivieren Sie fünf Vertiefungen mit Organoiden pro Elektroporationsprobe in einer 48-Well-Platte. Bereiten Sie 230 Mikroliter Dissoziationsreagenz mit 10 Mikromolaren Y27632 pro Vertiefung vor. Überwachen Sie die Organoide unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Vertiefungen und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch in der vorbereiteten Dissoziationsmischung. Bündeln Sie fünf Vertiefungen pro Elektroporationsprobe in einem 15-Milliliter-Röhrchen.
Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch Vortexen und inkubieren Sie es 5 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, bis Cluster von 10 bis 15 Zellen entstehen, wobei Sie die Dissoziation mit dem Mikroskop überprüfen. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie bis zu 10 Milliliter Basalmedium ohne Antibiotika hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 450 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 Millilitern Elektroporationspuffer. Zentrifugieren und den Überstand nach jedem Waschen entsorgen. Nach dem Waschen resuspendieren Sie das Organoid-Pellet in 100 Mikrolitern Elektroporationspuffer mit 30 Mikrogramm Plasmid-DNA.
Geben Sie das komplette DNA-Organoid-Gemisch in eine Elektroporationsküvette. Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie die Elektroporationsparameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und klopfen Sie mit einem Finger auf die Küvette, um die Zellen vorsichtig zu mischen. Setzen Sie die Küvette in die Küvettenkammer ein und drücken Sie die Impedanztaste am Elektroporator, um den Impedanzwert zu notieren. Drücken Sie die Start-Taste, um das Elektroporationsprogramm zu starten und die Werte der angezeigten Ströme, Spannungen und Energien zu steuern.
Nach der Elektroporation sofort 500 Mikroliter Nährmedium ohne Antibiotika zu den Zellen geben und durch Auf- und Abpipettieren mischen. Füllen Sie die Probe in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie die Küvette mit Basalmedium, um die restlichen Zellen zu sammeln, und inkubieren Sie die Zellen dann 40 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 450-mal g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Kellermatrix und säen Sie 20 Mikroliter Tropfen in eine vorgewärmte 48-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zur Polymerisation und fügen Sie 250 Mikroliter Kulturmedium hinzu, das mit Y27632 und CHIR-99021 pro Vertiefung ergänzt ist. Um die Transfektionseffizienz zu bestimmen, überprüfen Sie die Fluoreszenz in der Transfektionskontrolle unter dem Mikroskop nach 24 bis 48 Stunden.