Bildgebung der Kalziumdynamik in Pankreaszellen: Eine Technik zur Untersuchung von Echtzeitänderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration auf der Pankreasinsel

- Pankreasinseln sind eine Ansammlung von hormonproduzierenden Pankreaszellen, die eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase spielen. Eine erhöhte Glukosekonzentration löst den Verschluss von Kaliumionenkanälen aus und verhindert so den Ausfluss von Kaliumionen, was zu einer Membrandepolarisation führt. In der Folge öffnen sich spannungsabhängige Calciumionenkanäle, die den Einstrom von Calciumionen ermöglichen. Diese erhöhte zytosolische Kalziumkonzentration regt die Ausschüttung von Hormonen wie Insulin an. Um die zytosolische Kalziumdynamik abzubilden, übertragen Sie in Echtzeit einige Inseln, die mit geeignetem Kalziumindikatorfarbstoff beladen sind, zwischen die Abstandswände eines vormontierten feinen Netzes.

Positionieren Sie das Netz kopfüber auf einem Deckglas, das in der Bildgebungskammer eines inversen Mikroskops eingesetzt ist. Platzieren Sie ein grobes Netz und ein Gewicht, um die Zellen zu immobilisieren. Geben Sie die Bildgebungslösung in die Kammer. Richten Sie als Nächstes ein Perfusionssystem ein, um Glukose oder ein Testhormon von Interesse einzuführen. In den Zellen zeigen vorgeladene fluoreszierende Calciumindikatoren einen Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentrationen an. Bei der Bindung an Calciumionen zeigen die Indikatormoleküle einen erheblichen Anstieg der Fluoreszenzemission. Im folgenden Protokoll werden wir die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumdynamik in murinen Pankreasinseln als Reaktion auf Glukoseperfusion zeigen.

- Um die Inselzellen für die Bildgebung zu immobilisieren, bauen Sie eine Bildgebungskammer für ein inverses Mikroskop zusammen und legen Sie ein Glasdeckglas in die Kammer. Vergewissern Sie sich, dass die Glaskammerschnittstelle wasserdicht ist, und vergewissern Sie sich, dass sich das Deckglas in Reichweite des Mikroskopobjektivs befindet. Schneiden Sie anschließend 20 x 20 Millimeter große Quadrate aus feinem und grobem Netz und verwenden Sie 45 bis 50 Mikrometer dicke Klebebandstücke, um zwei Abstandswände auf einem Stück feinem Netz zu erstellen. Tauchen Sie das grobe Netz und ein Gewicht in eine 35-Millimeter-Petrischale mit bildgebender Lösung und legen Sie das feine Netz unter ein Präpariermikroskop.

Drehen Sie das feine Netz mit den Abstandswänden auf den Kopf und den Abstandshaltern nach oben und übertragen Sie mit einer P20-Pipette mehrere Inselzellen zwischen die beiden Abstandhalter. Platzieren Sie das Netz mit einer Uhrmacherzange kopfüber in der Bildgebungskammer des inversen Mikroskops, so dass die Abstandshalter nach unten zeigen und direkt auf dem Deckglas der Kammer sitzen, wobei die Inseln zwischen den Abstandshaltern und dem Netz in der Mitte des Deckglases eingeklemmt werden.

- Achten Sie darauf, dass das Netz gut hydratisiert ist, ohne übermäßige Lösungsmengen zu enthalten, die die seitliche Bewegung der Probe provozieren würden.

- Platzieren Sie dann das grobe Netz und das Gewicht auf dem feinen Netz in der Kammer und geben Sie Bildgebungslösung in die Kammer. Sobald die Inselzellen immobilisiert sind, wählen Sie den Bildgebungsmodus und das Objektiv am inversen Mikroskop und platzieren Sie die Kammer mit den Inselzellen auf dem temperaturgesteuerten Tisch des Mikroskops. Positionieren Sie nach dem Einstellen der Perifusion den Zufluss tiefer als den Ausfluss in der Kammer und stellen Sie den Abflussfluss so ein, dass er größer als der Zuflussfluss ist.

Es ist sicherzustellen, dass der Ausfluss nur minimalen Kontakt mit der Lösung hat, so dass er die Lösung in mehreren aufeinanderfolgenden kleinen Tröpfchen in langen Intervallen der kontinuierlichen Lösungsentfernung entfernt. Als nächstes wird die Perifusion mit einer Bildgebungslösung eingeleitet, die 3 Millimolare Glukose enthält, und wählen Sie den Strahlengang und die Filter für die Abbildung grüner Fluorophore aus. Führen Sie dann Live-Imaging aus, um die Imaging-Parameter einzurichten und die Ansicht so anzupassen, dass die interessierenden Inselzellen erfasst werden.

Um das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes zu optimieren, passen Sie die Intensität des Anregungslichts, die Belichtungszeit und das Binning an und stellen Sie sicher, dass die Einstellungen eine eindeutige Visualisierung jeder Zelle innerhalb der Inseln bei der geringstmöglichen Lichtintensität und Belichtung ermöglichen. Bilden Sie dann die Inselzellen bei 0,1 bis 5 Hertz ab und überprüfen Sie die Qualität der erfassten Daten während der Erfassung.