Primäre Isolierung von Azinuszellen: Eine Methode zur Isolierung von Azinuszellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus

- Eine Azinuszelle der Bauchspeicheldrüse ist eine exokrine Zelle, die eine Vielzahl von Verdauungsenzymen enthält. Manchmal wandelt sich die Azinuszelle als Reaktion auf onkogene Signale in eine duktale Zelle um. Diese duktale Zelle kann später krebsartig werden. Daher ist es wichtig, die Azinuszellen zu isolieren, um ihre Rolle bei der Entstehung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu untersuchen.

Beginnen Sie damit, die Bauchspeicheldrüse von einer euthanasierten Maus zu isolieren. Geben Sie die Bauchspeicheldrüse in eine Waage, die eine ausgewogene Salzlösung enthält, die mit einem Antibiotikum ergänzt wird. Die Bauchspeicheldrüse mit einer Schere in kleine Stücke hacken und das Bauchspeicheldrüsengewebe in ein Röhrchen geben. Geben Sie anschließend Kollagenaselösung zu den Bauchspeicheldrüsenstücken in der Tube.

Kollagenase verdaut das Kollagen, das das Gewebe zusammenhält, so dass das Gewebe in feine Stücke zerfällt. Geben Sie nun serumhaltiges Medium in das Röhrchen und legen Sie das Gewebe auf Eis. Dies hilft, die Wirkung der Kollagenase zu stoppen.

Filtern Sie das Gewebe und das Medium zweimal, wobei die Maschenöffnung des Filters jedes Mal schrittweise verringert wird, um eine feine Gewebesuspension zu erhalten. Zum Schluss zentrifugieren Sie die resultierende Suspension, um die Azinuszellen im Pellet zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie die Azinuszellen für die weitere Analyse. Im folgenden Protokoll werden Azinuszellen aus der Bauchspeicheldrüse einer euthanasierten Maus isoliert.

- Um die Bauchspeicheldrüse einer euthanasierten Maus zu sezieren, stecken Sie zuerst die Pfoten der Maus an den Styropordeckel, richten Sie ihn so aus, dass der Schwanz dem Forscher zugewandt ist, und besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine autoklavierte Pinzette, um das Fell und die Haut an der Mittellinie anzuheben, und machen Sie mit einer autoklavierten Schere einen Schnitt durch das Fell und die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Bereich des Zwerchfell-Brustkorbs. Machen Sie zusätzliche Schnitte links und rechts, um das Fell und die Haut abzuschneiden, wodurch eine klare Sicht auf die Bauchhöhle entsteht.

Schneiden Sie dann in der Mitte sowie rechts und links in die Bauchfellschleimhaut und ziehen Sie sie von den Organen weg. Heben Sie die Eingeweide mit der Pinzette an und bewegen Sie sie auf die linke Seite der Maus, um Platz für die hellrosa Bauchspeicheldrüse zu schaffen, die an der dunkelroten ovalen Milz befestigt ist. Das Bauchspeicheldrüsengewebe hat eine weiche, schwammige Textur. Schneide die Bauchspeicheldrüse heraus, die entlang des Magens verläuft und mit dem Darm verflochten ist.

Trennen Sie die Milz von der Bauchspeicheldrüse und legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter HBSS mit 1X Penicillin-Streptomycin enthält, und übertragen Sie es in die Laminar-Flow-Haube. Gießen Sie den Inhalt des Röhrchens in ein leeres Waagschiffchen und waschen Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette, indem Sie sie schwenken. Bewegen Sie dann die Bauchspeicheldrüse mit der Pinzette zu einer zweiten Waage, die HBSS mit Penicillin-Streptomycin enthält, und waschen Sie sie erneut durch Verwirbeln.

Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse in die dritte Waage, die HBSS mit Penicillin-Streptomycin enthält, und beginnen Sie, die Bauchspeicheldrüse in 5 Millimeter oder kleinere Stücke zu schneiden. Um den Inhalt der Waage in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen zu gießen, bewegen Sie zunächst mit der Pinzette die Bauchspeicheldrüsenstücke in die Flüssigkeit, während das Boot gekippt wird. Sobald die Stücke nicht mehr am Boot befestigt sind, gießen Sie den Inhalt in das Rohr. Nehmen Sie die restlichen Stücke mit der Pinzette auf und waschen Sie die Pinzette im Röhrchen.

Nachdem Sie das Röhrchen zwei Minuten lang bei 931-facher Schwerkraft bei 4 Grad Celsius zentrifugiert haben, verwenden Sie eine 5-Milliliter-Pipette, um das HBSS und das schwimmende Fett zu entfernen. Fügen Sie 5 Milliliter Kollagenase hinzu, verdünnt in HBSS. Verschließen Sie die Tube und sorgen Sie für einen versiegelten Deckel, indem Sie die Tube in Plastikparaffinfolie einwickeln. Legen Sie es in einen Inkubator und schütteln Sie es 20 Minuten lang bei 220 U/min bei 37 Grad Celsius, wodurch eine trübe Lösung und einige verbleibende Gewebestücke entstehen.

Um die Dissoziation zu stoppen, legen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie 5 Milliliter kaltes HBSS mit 5% FBS hinzu. Nach dem Zentrifugieren bei 931-facher Schwerkraft bei 4 Grad Celsius für zwei Minuten wird der Überstand mit einer 5-Milliliter-Pipette entfernt. Das Pellet in 10 Millilitern HBSS mit 5 % FBS resuspendieren und erneut bei 931-facher Schwerkraft für zwei Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand mit einer 5-Milliliter-Pipette und wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren 10 Millilitern HBSS mit 5 % FBS. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern HBSS mit 5% FBS. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellsuspension jeweils 1 Milliliter durch ein 500-Mikrometer-Netz in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu filtrieren.

Um verbleibende Pankreaszellen durch das Netz zu waschen, fügen Sie weitere 5 Milliliter HBSS mit 5 % FBS hinzu. Verwenden Sie dann eine P1000-Pipette, um dieses Filtrat jeweils 1 Milliliter durch das 105-Mikrometer-Netz in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu leiten. Pipettieren Sie diese Zellsuspension vorsichtig in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das HBSS mit 30 % FBS enthält, das oben eine Schicht aus Zellsuspension bildet.

Diese Zellsuspension wird bei 233-facher Schwerkraft bei 4 Grad Celsius zwei Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie das Pellet mit den Azinuszellen in dem vollständigen Medium von 1X Waymouth.