Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

- Inselzellen in der Bauchspeicheldrüse produzieren essentielle Hormone, die an den endokrinen Funktionen beteiligt sind. Um Inselzellen zu isolieren, wird zunächst eine euthanasierte Maus gesichert und ihre Bauchhöhle chirurgisch freigelegt. Bürsten Sie die Leber und den Darm beiseite, um den gemeinsamen Gallengang zu lokalisieren und abzuklemmen. Identifizieren Sie die Ampulle von Vater, den Gang, der durch die Vereinigung von Bauchspeicheldrüse und Gallengang gebildet wird.

Als nächstes injizieren Sie eine Kollagenase-Enzymlösung in den gemeinsamen Gallengang. Der Rückfluss aus dem Gang bläht die Bauchspeicheldrüse erfolgreich auf und erleichtert die Kollagenase-induzierte Dissoziation des Pankreasgewebes. Exzidieren Sie die Bauchspeicheldrüse in ein Röhrchen, das mehr Kollagenaselösung enthält. Zerkleinern Sie das Gewebe mechanisch und inkubieren Sie, um die Gewebeverdauung durch die Kollagenase zu unterstützen.

Sobald Sie eine homogene Suspension erhalten haben, stoppen Sie den enzymatischen Verdau, indem Sie eine Lösung hinzufügen, die Proteine enthält, die die Kollagenaseaktivität hemmen. Zentrifuge, um ein Gewebepellet zu sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Dichtegradientenmedium, schichten Sie einen geeigneten Puffer darüber und zentrifugieren Sie, um Gradientenschichten zu erzeugen.

Sammeln Sie Inselzellen aus der Schicht, die zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem Puffer gebildet wurde. Wählen Sie schließlich gesunde Inselchen für den Anbau aus. Im folgenden Protokoll werden wir die Isolierung von murinen Pankreasinseln durch Kollagenase-Verabreichung und anschließende Dichtegradientenzentrifugation demonstrieren.

- Beginnen Sie damit, die Gliedmaßen der Maus in Rückenlage zu kleben und den Körper mit 70% Ethanol zu besprühen. Machen Sie mit einer Zange aus Deckglas und einer gebogenen chirurgischen Schere einen etwa 3 Zentimeter langen horizontalen Schnitt in die Bauchhaut und ziehen Sie die Haut auf, um die Bauchdecke freizulegen. Machen Sie einen 3 bis 4 Zentimeter großen vertikalen Schnitt am Bauchfell, um die Bauchspeicheldrüse vollständig freizulegen, und legen Sie die Maus unter ein Präpariermikroskop.

Schieben Sie den Leberlappen nach vorne, um den Gallengang freizulegen, der als blasse, rosa Röhre erscheint, und bewegen Sie den Darm vorsichtig von der rechten Lenden- und Beckenregion nach rechts von der Bauchhöhle, um den Gallengang und die Leberarterie freizulegen. Verwenden Sie Schwartz Micro Serrefines, um den Gallengang communis vorsichtig so nah wie möglich an der Leber zu klemmen und die Ampulle von Vater zu identifizieren, die sich an der Zwölffingerdarmpapille befindet und durch die Verbindung des Pankreasgangs und des Gallengangs communis gebildet wird.

Führen Sie mit einer Micro-Adson-Pinzette, um den gemeinsamen Gallengang straff zu ziehen, eine 30-Gauge-Nadel mit einem halben Zoll, die an einer 3-Milliliter-Spritze befestigt ist, die 3 Milliliter frisch zubereitete Kollagenase-P-Lösung enthält, in die Ampulle von Vater ein und schieben Sie die Nadel in den Kanal parallel zum Gefäß für etwa ein Viertel der Länge des Gefäßes. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, stabilisieren Sie die Nadel mit einer Micro Adson-Pinzette und injizieren Sie langsam und stetig 3 Milliliter Kollagenase-P-Lösung in den Kanal. Die Injektion gilt als erfolgreich, wenn die Kopf-, Hals-, Körper- und Schwanzregion der Bauchspeicheldrüse vollständig aufgebläht sind.

- Der richtige Eintritt in die Ampulle und die Kanülierung des Gallengangs sind entscheidend für eine erfolgreiche Verdauungsernte. Das Durchstechen der Kanalwände verringert die Wirksamkeit der Isolierung.

- Ziehen Sie die aufgeblähte Bauchspeicheldrüse vorsichtig mit einer gebogenen und Micro Adson-Pinzette heraus, beginnend an der Milz und weiter in Richtung Magen und entlang des Zwölffingerdarms. Legen Sie dann die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Verdauungsröhrchen mit 3 Millilitern eiskalter Kollagenase-P-Lösung. Um die Inseln zu ernten, hacken Sie die Bauchspeicheldrüse zunächst mit einer feinen chirurgischen Schere 3 bis 5 Sekunden lang, bevor Sie die Röhre 12 bis 13 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad mit 100 bis 120 Umdrehungen pro Minute legen.

Schütteln Sie das Röhrchen am Ende der Inkubation vorsichtig für etwa 30 Sekunden, um das Gewebe zu zerkleinern, bis die Lösung homogen ist, was durch feine, sandartige Pankreasgewebepartikel bestätigt wird. Sobald das Gewebe verdaut ist, legen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie 40 Milliliter eiskalte Stopplösung hinzu, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Nachdem Sie das Pellet vorsichtig aufgebrochen haben, schleudern Sie das Verdauungsgewebe in einer schwingenden Eimerzentrifuge, gefolgt von zwei Zentrifugen mit 20 Millilitern frischer Stopplösung pro Waschgang.

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in 40 Millilitern eiskaltem HBSS für drei weitere Wäschen und resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern Lösung mit Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur nach der letzten Wäsche. Das Röhrchen kurz bei niedriger Geschwindigkeit vortexen, bis die Lösung homogenisiert ist, bevor dem Röhrchen weitere 5 Milliliter Dichtegradient bei Raumtemperatur zugesetzt werden. Geben Sie nun mit einer 10-Millimeter-Pipette vorsichtig und langsam 10 Millimeter HBSS bei Raumtemperatur tropfenweise in das Röhrchen, um die Bildung eines Gradienten zu ermöglichen, und verwenden Sie eine schwingende Eimerzentrifuge, um die Zellpopulationen durch Dichtegradiententrennung zu isolieren.

Am Ende der Zentrifugation wird mit einer 10-Milliliter-Pipette 5 bis 10 Milliliter der Inselschicht zwischen dem Dichtegradienten und dem HBSS vorbefeuchtet. Füllen Sie die Inselzellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern frischem, eiskaltem HBSS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in einer schwingenden Eimerzentrifuge. Saugen Sie alle bis auf die letzten 3 Milliliter des Überstands vorsichtig ab, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie die Inselzellen mindestens drei weitere Male mit 20 Millilitern frischem HBSS pro Waschgang.

Ersetzen Sie nach der letzten Wäsche den Überstand durch 4 Milliliter 37 Grad Celsius RPMI 1640 Medium und schwenken Sie das Rohr vorsichtig, um das Pellet zu lösen. Gießen Sie die Inseln sofort in eine 100-Millimeter-Petrischale und waschen Sie das Röhrchen mit 5 Millilitern frischem RPMI 1640 Medium, um alle verbleibenden Inselzellen zu sammeln, und legen Sie die Wäsche mit den anderen Inseln zusammen.

Verwenden Sie dann ein Seziermikroskop und eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, um gesunde kugelförmige oder längliche, goldbraune Inseln mit glatter Oberfläche aus der Petrischale zu entnehmen und in eine neue Petrischale mit 10 Millilitern vollständigem RPMI 1640-Medium zu übertragen. Wenn alle Inselzellen gesammelt sind, legen Sie die Inselzellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in befeuchteter Luft in den sterilen Inkubator.