Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden: Eine Technik zur Analyse von Sphäroiden auf die Expression der intra- und extrazellulären Antigenexpression

- Sphäroide sind dreidimensionale in vitro Zellkulturmodelle. Für die Immunfluoreszenzfärbung wird zunächst eine Sphäroidkultur des gewünschten Zelltyps in einer Multiwell-Platte erzeugt. Sammeln Sie die Sphäroide mit einer Mikropipette mit breiter Blende und achten Sie darauf, dass sie nicht durch Scherkräfte reißen.

Als nächstes fixieren und permeabilisieren Sie die Sphäroide, um einzelne Zellen durchlässig zu machen. Inkubieren Sie nun mit einer Lösung, die Proteine enthält, um unspezifische Proteininteraktionsstellen auf der Zelloberfläche zu blockieren. Behandeln Sie die Sphäroide mit einem gewünschten Primärantikörper-Cocktail. Inkubieren, damit die Antikörper an die Zielmoleküle auf der Zelloberfläche binden können.

Als nächstes markieren Sie die Sphäroide mit einer fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörperlösung, die spezifisch für die Primärantikörper ist. Behandeln Sie schließlich die Sphäroide mit einem geeigneten fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff, um Zellkerne zu färben. Mit einem Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop können Sie mehrere optische Querschnitte des Sphäroids in verschiedenen optischen Ebenen abbilden.

Die aufgenommenen Bilder reflektieren fluoreszenzmarkierte Zellkerne und Antigene von Interesse. Führen Sie die Stapel mit der entsprechenden Software zusammen, um das endgültige zusammengesetzte Bild des 3D-Sphäroids zu erhalten. Im folgenden Protokoll werden wir eine Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden von Pankreasfibroblasten und krebsassoziierten Fibroblasten durchführen, die in Gegenwart eines Stimulans, TGF beta 1, kultiviert wurden.

- Schneiden Sie zuerst das Ende einer Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie diese abgeschnittene Pipettenspitze, um die Sphäroide in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen zu sammeln, je nach Versuchsbedingung oder pro zu analysierendem Protein. Zentrifugieren Sie die Sphäroide bei 1.000 mal g für etwa 30 bis 60 Sekunden. Entfernen Sie den methylcellulosehaltigen Überstand vorsichtig durch Pipettieren, wobei Sie darauf achten müssen, die pelletierten Sphäroide nicht zu stören.

- Besondere Vorsicht ist bei der Übertragung der Sphäroide auf die Reaktionsgefäße geboten. Stellen Sie sicher, dass Sie keine Scherspannungskräfte haben, indem Sie die Spitze abschneiden. Es ist auch wichtig, dass du alle Sphäroide sammelst. Achten Sie während des Waschvorgangs darauf, dass Sie die Sphäroide nicht durch Aspiration verlieren.

- Um die Sphäroide bei 50 Mikrolitern 1X PBS zu waschen, zentrifugieren Sie 30 bis 60 Sekunden lang bei 1.000 g und entfernen Sie dann vorsichtig das PBS durch Pipettieren. Je nach zu färbendem Protein fixieren Sie die Sphäroide entweder mit 50 Mikrolitern 4%igem Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Sphäroide mit PBS, wie zuvor beschrieben. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Triton X in PBS für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Sphäroide dreimal in PBS, wie zuvor beschrieben. Geben Sie PBS mit 5 % FBS und 2 % BSA zu den Sphäroiden und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um unspezifische Proteininteraktionsstellen zu blockieren.

Inkubieren Sie nun die Sphäroide mit 30 Mikrolitern Primärantikörpern in PBS mit 2,5 % FBS und 1 % BSA bei 4 Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie die Sphäroide am nächsten Tag dreimal in PBS, wie zuvor beschrieben.

Danach inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 Mikrolitern Sekundärantikörpern in PBS mit 2,5 % FBS und 1 % BSA bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Waschen Sie die Sphäroide dreimal in PBS, wie zuvor beschrieben.

Inkubieren Sie die Zellen anschließend mit 30 Mikrolitern DAPI-Färbelösung für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Sphäroide einmal in PBS, wie zuvor beschrieben. Legen Sie die Sphäroide mit einer Pasteur-Glaspipette auf einen Objektträger in einem Tropfen PBS. Verwenden Sie ein Laser-Scanning-Mikroskop, um die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer 10-fachen Vergrößerung abzubilden. Nehmen Sie unterschiedliche optische Querschnitte des Sphäroids auf verschiedenen optischen Ebenen eines Z-Stapels auf.