Magnetisch biogedruckte 3D-Sphäroid-Co-Kulturen: Eine Methode zur Co-Kultivierung von Krebszellen und Fibroblasten

- In magnetischen biogedruckten 3D-Co-Kulturen bilden mehrere Zelltypen unter dem Einfluss von Magnetfeldern 3D-Strukturen oder Sphäroide. Um die Kultur einzurichten, bereiten Sie zunächst Einzelzellsuspensionen von Krebszellen und Fibroblasten in ihrem geeigneten Medium vor. Fügen Sie als Nächstes biokompatible magnetische Nanopartikel zu beiden Suspensionen hinzu. Diese Nanomaterialien enthalten positiv geladene Poly-L-Lysin-Reste, die die unspezifische Bindung magnetischer Partikel an die Zellmembran über elektrostatische Wechselwirkungen erleichtern.

Inkubieren, um eine maximale Magnetisierung von Krebszellen und Fibroblasten zu erreichen. Mischen Sie anschließend beide Zellsuspensionen im gewünschten Verhältnis. Übertragen Sie diese Zell-Nanopartikel-Suspension auf eine zellabweisende Kulturplatte, die speziell optimiert ist, um eine Zellanhaftung zu verhindern. Montieren Sie dieses Setup auf einem Magnetlaufwerk und inkubieren Sie. Magnetische Kräfte leiten die Aggregation oder das Bioprinting von magnetisierten Krebszellen und Fibroblasten zu 3D-Sphäroidstrukturen am Boden der Vertiefung.

Sobald sich Sphäroide gebildet haben, entfernen Sie den Magneten und lassen Sie die 3D-Co-Kulturen auf das gewünschte Volumen wachsen. In diesem Protokoll werden wir die Erzeugung von dreidimensionalen Co-Kultur-Sphäroiden aus Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und PS1-aktivierten Pankreasfibroblastenzellen mittels magnetischer Bioprinting-Technik demonstrieren.

Unter Verwendung der standardmäßigen aseptischen Gewebekulturtechnik werden die Krebszellen und Fibroblasten von Interesse in T75-Kolben in dem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen, waschen Sie die Kulturen einmal in 5 Millilitern PBS und lösen Sie die Zellen von den Kolbenoberflächen mit 2 Millilitern 0,05 % Trypsin-EDTA pro Kolben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach Bestätigung der Ablösung unter dem Mikroskop wird das Trypsin mit 8 Millilitern Wachstumsmedium pro Kolben deaktiviert. Und pipettieren Sie die Zellen einige Male, um Einzelzellsuspensionen für die Zählung zu erzeugen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 1 mal 10 bis zu einem sechsten Zellen pro Milliliter in frischem Wachstumsmedium.

Um die Zellen zu magnetisieren, geben Sie 10 Mikroliter NanoShuttle in Wachstumsmedium pro 100 Mikroliter Zellen und rühren Sie die Lösungen vorsichtig um. Drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig um und überführen Sie die cell-NanoShuttle-Mixe in einzelne Wells einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln, um die Bindung des NanoShuttles an die Zelloberfläche zu erleichtern. Am Ende der Bindungsinkubation mischen Sie jede magnetisierte Zellsuspension vorsichtig durch Pipettieren und stellen Sie die Konzentration auf 1,5 mal 10 bis zur vierten magnetisierten Krebszelle oder Fibroblasten pro 150 Mikroliter Medium ein.

Mischen Sie die Fibroblasten- und Krebszellen im Verhältnis 2 zu 1, um insgesamt 150 Mikroliter ausgesäte Zellen pro Vertiefung zu erhalten. Setzen Sie die zellabweisende 96-Well-Platte auf einen magnetischen 96-Well-Sphäroidantrieb mit dünneren Magneten und säen Sie 150 Mikroliter Zellmischung in jedes Well. Wenn alle Zellen plattiert sind, inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, wobei der magnetische Sphäroidantrieb noch angebracht ist. Entfernen Sie am nächsten Morgen den Magnetstick und legen Sie die Zellen für bis zu sieben weitere Tage in den Inkubator zurück.