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Krebsforschung
0 Ansichten • 3:14 Min. • April 30th, 2023
- Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs (CSCs) sind eine Untergruppe der selbsterneuernden Krebszellen und können den gesamten Tumor hervorbringen. CSCs befinden sich in einer gut geschützten Nische, die aus anderen Zellen wie Fibroblasten, Immunzellen, Endothelzellen und extrazellulären Matrixkomponenten wie Zytokinen und Wachstumsfaktoren besteht. Die Interaktionen, die zwischen den Zellen in einer solchen Umgebung stattfinden, helfen den CSCs, sich zu vermehren und das Tumorwachstum zu erhöhen.
Um die Eigenschaften von CSCs zu untersuchen, isolieren wir sie aus den Pankreastumoren. Beginnen Sie mit der Entnahme der Zellsuspension aus menschlichem Pankreastumorgewebe in einem CSC-Wachstumsmedium. Anschließend wird die Suspension, die hauptsächlich aus Fibroblasten und CSCs besteht, auf eine mit Gelatine beschichtete Platte ausgesät und für die gewünschte Dauer inkubiert. Fibroblasten haften an der Gelatineoberfläche und lassen die frei schwebenden CSCs in der Zellsuspension zurück.
Nehmen Sie eine kleine Menge Zellsuspension und fügen Sie Trypanblau hinzu. Pipettieren Sie diese Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Trypanblau dringt in die abgestorbenen Zellen ein und färbt sie blau, wodurch die lebenden Zellen farblos werden. Speichern Sie abschließend die CSCs für die weitere Analyse.
Im folgenden Protokoll werden wir die CSCs aus Pankreastumoren isolieren.
- Um Krebsstammzellen aus einem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse in einer sterilen Biosicherheitswerkbank zu isolieren, verwenden Sie ein steriles Skalpell und eine Pinzette, um den menschlichen Tumor in einer 60 x 15 Millimeter großen Kulturschale zu zerkleinern, die einen Milliliter steriles PBS enthält, und fügen Sie bei Bedarf weitere drei bis vier Milliliter PBS hinzu, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist.
Die Gewebesuspension wird in ein steriles konisches Röhrchen überführt und PBS bis zu einem Endvolumen von fünf Millilitern zugegeben. Dann wird die Probe mechanisch mit dem Dissoziator homogenisiert, zentrifugiert und das homogenisierte Gewebe mit Kollagenase bei 37 Grad Celsius verdaut.
Nach einer Stunde zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren das Pellet in 10 Millilitern vollständigem Medium. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb und schleudern Sie die Zellen erneut herunter, wobei das Pellet diesmal in fünf Millilitern ACK resuspendiert wird.
Entfernen Sie nach fünf Minuten bei Raumtemperatur den Lysepuffer der roten Blutkörperchen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in Krebsstammzellmedium. Dann inkubieren Sie die Zellen auf einer mit Gelatine überzogenen Schale bei 37 Grad Celsius, um die meisten der sich schnell anheftenden Fibroblastenzellen zu entfernen. Nach einer Stunde wird der Überstand entnommen und die Anzahl lebensfähiger Bauchspeicheldrüsenkrebszellen quantifiziert.