JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:24 Min. • April 30th, 2023
- Das Spinalganglion oder DRG sind sensorische Neuronen, die Nachrichten von der Peripherie an das zentrale Nervensystem weiterleiten. Im Gegensatz dazu sind Neuronen des Myenterusplexus an den peristaltischen Bewegungen des Darms beteiligt.
Bei Krebserkrankungen wie Bauchspeicheldrüsenkrebs verändern sich diese Neuronen morphologisch und funktionell. Um die Veränderungen der neuronalen Morphologie zu untersuchen, säen Sie die Nervenzellen auf Deckgläsern, die mit Laminin-Protein vorbeschichtet sind, legen Sie sie in eine Multiwell-Platte und bedecken Sie die Zellen mit dem neuralen Basalmedium.
Das Laminin-Protein fördert das Wachstum von Neuriten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Als nächstes fügen Sie das Pankreaskarzinom-Gewebeextraktmedium in die ersten drei Vertiefungen und gesundes Pankreasgewebe-Extraktmedium in die folgenden drei Vertiefungen hinzu. Inkubieren Sie die Platte. Führen Sie nun eine immunhistochemische Färbung mit neuronenspezifischen Antikörpermarkern durch, die an Neuronen binden. Legen Sie das Deckglas auf den Objektträger und legen Sie den Objektträger unter ein inverses Mikroskop. Messen Sie die Neuritendichte mit der Software.
Die DRG-Neuronen, die in Pankreaskarzinom-Gewebeextrakt kultiviert werden, weisen in der Regel eine höhere Neuritendichte auf als in gesundem Pankreasgewebeextrakt. Im Gegensatz dazu bilden Neuronen des Myenterusplexus längere Neuriten als in gesunden Pankreasgewebeextrakten. Im folgenden Protokoll werden wir einen In-vitro-Neuroplastizitätstest an den DRG- und Myenterus-Neuronen einer neugeborenen Maus durchführen.
- Um die Zellen für die Kultur vorzubereiten, verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Gesamtzahl der Neuronen und Gliazellen zu schätzen. Anschließend säen Sie die Zellen auf 13 Millimeter vorbeschichteten Deckgläsern in einer 24-Well-Platte. Welche Beschichtung verwendet wird, hängt von den Versuchszielen ab. Als nächstes bedecken Sie die Vertiefungen mit neuralem Basalmedium und lassen Sie die Zellen über Nacht an den Vertiefungen haften. Tauen Sie am nächsten Tag das mit Gewebeextrakt ergänzte Medium oder das mit Zelllinie überstehende ergänzte Medium auf.
Anschließend wird das Sämedium aus den DRGs abgesaugt und optional eine sehr schonende Reinigung mit PBS durchgeführt. Pipettieren Sie dann langsam das mit Gewebeextrakt ergänzte Medium oder das mit Zelllinienüberstand ergänzte Medium auf die Zellen, um 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Lassen Sie nun die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in dem mit Gewebeextrakt oder Zelllinienüberstand versorgten Medium wachsen. Nach 48 Stunden aspirieren Sie das Medium und fixieren Sie es mit 4 % Paraformaldehyd für die Immunfärbung.
Für die doppelte Immunfluoreszenzfärbung verwenden Sie neuronenspezifische und gliaspezifische Marker. Verwenden Sie für die Morphometrie ein inverses Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera in Kombination mit einer automatisierten Software ausgestattet ist, um die Neuritendichte zu messen. Messen Sie mit 200-facher Vergrößerung die Neuritendichte von neuronalen Kulturen, indem Sie ein 50 x 50 Mikrometer großes Gitter überlagern und die Faserdichte pro Quadrat zählen, gemessen in den sich schneidenden Fasern. Wiederholen Sie diese Analyse für vier verschiedene Regionen mit dem dichtesten Bewuchs auf vier bis fünf repräsentativen Mikroaufnahmen auf jedem Deckglas.
Messen Sie das Neuritenwachstum, die mittlere Anzahl der Äste pro Neuron, die mittlere Astlänge und die perikaryonale Größe von 30 zufällig ausgewählten solitären Neuronen aus jedem Deckglas, indem Sie die Neuriten und Perikarya markieren.