PTM-basiertes Tumor-Mikroumgebungs-Monitoring: Eine Methode zur Verfolgung von Veränderungen der EZM-Steifigkeit mit Hilfe von Tumor-Sphäroiden

- Bei der Tumorinvasion durchlaufen die peripheren Tumorzellen eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT), was zu einem lokalen Abbau der extrazellulären Matrix oder EZM führt. Wir können die Interaktion von Tumorzellen mit der EZM in vitro untersuchen.

Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, wird ein vorgeformtes Sphäroid aus Pankreastumorzellen auf eine Platte übertragen, die ein Kollagengerüst zusammen mit eingebetteten fluoreszierenden Tracersonden und Kulturmedien enthält. Tumorsphäroide setzen Proteasen frei, die Kollagen abbauen und die EZM-Steifigkeit verringern, was zu einer freien Bewegung der Tracersonden in der EZM führt.

Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Zeitdauer. Beobachten Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop, um das Raster der Probenpunkte im Kollagengerüst zu betrachten und Videodaten von ihnen aufzunehmen. Der Bereich der Matrix in der Nähe des Sphäroids zeigt den maximalen Kollagenabbau. Daher hat es die Sondenbewegung erhöht. Im Gegensatz dazu zeigt der Bereich, der weiter vom Sphäroid entfernt ist, einen geringeren Kollagenabbau, was zu einer eingeschränkten Bewegung der Sondenmoleküle führt.

Diese Technik zur Untersuchung der rheologischen Eigenschaften der EZM durch Messung der Trajektorien von Tracerpartikeln ist als Partikelverfolgungsmikrorheologie oder PTM bekannt. Im folgenden Protokoll werden wir einen Kugelbildungsassay durchführen, um Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu identifizieren und die Wirkung von Metformin zu bewerten.

Bereiten Sie zunächst einen Arbeitsplatz in einer Laminar-Flow-Haube mit zwei 2-Milliliter-Fläschchen vor. Fläschchen 1 enthält das Tumorsphäroid, und Fläschchen 2 ist eine zellfreie Kontrolle. Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus Carboxylat-modifizierten Fluoreszenzsonden mit einem Durchmesser von 1 Mikrometer vor, indem Sie 2 Teile Standardsonden zu 25 Teilen sterilem Wasser hinzufügen.

Nehmen Sie eine Flasche mit 3,1 Milligramm pro Milliliter Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und stellen Sie sie auf Eis. Aliquotieren Sie 125 Mikroliter Kollagen, gefolgt von 50 Mikrolitern verdünnter Tracersondenlösung, in Fläschchen 1. Kurz vortexen, um die Sonden zu verteilen.

Geben Sie dann 235 Mikroliter eines geeigneten Zellkulturmediums, das Phenolrot enthält, für ein Gesamtvolumen von 410 Mikrolitern hinzu und wirbeln Sie es kurz ein, bevor Sie 205 Mikroliter entfernen und in Fläschchen 2 geben. Geben Sie anschließend etwa 2 Mikroliter 1 molaren Natriumhydroxid in Fläschchen 1, um die Lösung wieder auf einen neutralen pH-Wert zu bringen. Zum Mischen kurz vorziehen. Kehren Sie dann sofort zum Eisgitter zurück, damit die Mischung nicht zu härten beginnt.

Entfernen Sie vorsichtig 40 Mikroliter Medium aus der Vertiefung, die das Tumor-Sphäroid enthält. Behalten Sie diese 40 Mikroliter bei, während Sie den nächsten Schritt durchführen. Überprüfen Sie die Vertiefung, um festzustellen, ob das Sphäroid im vorherigen Schritt entfernt wurde. Wenn nicht, geben Sie die 40 Mikroliter zurück in die Vertiefung und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.

Wenn ja, geben Sie die 40 Mikroliter mit dem Sphäroid in Fläschchen 1. Rühren Sie Fläschchen 1 vorsichtig um, bevor Sie die Mischung in 60-Mikroliter-Portionen in drei separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte umfüllen. Untersuchen Sie jede Vertiefung mit einem Mikroskop, nachdem Sie die Mischung hinzugefügt haben, um festzustellen, welche Vertiefung das Sphäroid enthält.

Geben Sie dann etwa 2 Mikroliter 1 molaren Natriumhydroxid und 40 Mikroliter Zellkulturmedium in das Fläschchen 2 und wirbeln Sie es ein, bevor Sie 60 Mikroliter dieser Mischung in eine leere Vertiefung in der 96-Well-Platte aliquotieren und als zellfreie Kontrolle markieren. Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um sie mindestens eine Stunde lang auszuhärten.

Um ein Raster von Probenpunkten zu erstellen, überführen Sie zunächst die Probenplatte aus dem Inkubator in den Mikroskoptisch. Lassen Sie die Probe 10 Minuten auf Raumtemperatur äquilibrieren, wenn kein beheizter Tisch zur Verfügung steht. Beobachten Sie die Probe mit Objektiven mit geringer Leistung, um sicherzustellen, dass sie intakt und bereit für die Bildgebung ist. Bestimmen Sie die Tumorposition innerhalb der Vertiefung und dokumentieren Sie diese mit einem Durchlichtbild für die anschließende räumliche Koregistrierung.

In der Regel führen 20 Probenpunkte in jeder Vertiefung, die in konzentrischen Ringen um das Sphäroid verteilt sind, zu ausreichend detaillierten Ergebnissen. Bewegen Sie den Tisch in jede gewünschte Position und verwenden Sie eine Mikroskop-Schnittstellensoftware, um die x- und y-Koordinaten aufzuzeichnen.

Schalten Sie das Mikroskop auf ein leistungsstarkes Objektiv um und wählen Sie den passenden Filterwürfel für die Anregungswellenlänge der Tracersonden aus. Wechseln Sie mithilfe der Liste der erstellten Punkte zum ersten Punkt im Raster. Passen Sie den Fokus an, um den Boden der Vertiefung zu finden, bevor Sie nach oben gehen, um ein Sichtfeld mit mehreren scharfen Leuchtsonden zu finden.

Beobachten Sie das Intensitätshistogramm und passen Sie die Belichtungsintensität und -zeit an, um den größtmöglichen Dynamikbereich zu erzielen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Bild nicht übersättigt wird. Erhalten Sie eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 Millisekunden pro Bild und speichern Sie sie mit einer geeigneten Namenskonvention. Berühren Sie während der Aufnahme nicht das Mikroskop oder den Tisch.

Wiederholen Sie die Aufnahme für jeden Sample-Punkt im Raster. Wiederholen Sie dann den Vorgang, um ein Gitter für jede Vertiefung im Experiment zu erstellen, und wiederholen Sie den gesamten Vorgang für jeden Zeitpunkt über die Dauer der Längsüberwachung.