Phosphatase-Assay in Darmkrebszellen: Eine Methode zur Untersuchung des Phosphorylierungsstatus des Tau-Proteins in Darmkrebszellen

- Das Tau-Protein lokalisiert peripher am Nukleolus in Darmkrebszellen und hilft bei der Aufrechterhaltung der Nukleolenstruktur. Meist exprimieren diese Zellen hyperphosphoryliertes Tau-Protein, was zu Arzneimittelresistenzen führt. Daher analysieren wir das Ausmaß der Tau-Phosphorylierung, indem wir einen Phosphatase-Assay durchführen.

Beginnen Sie mit der Einnahme des Zelllysats, das das Gesamtprotein aus menschlichen Darmkrebszellen enthält, in zwei Fläschchen, die als Test und Kontrolle gekennzeichnet sind. Behandeln Sie die Testprobe mit einem alkalischen Phosphatase-Enzym. Die alkalische Phosphatase entfernt die Phosphatgruppen aus Tau, während das Kontrollfläschchen das phosphorylierte Tau-Protein zurückhält.

Führen Sie als Nächstes sowohl die Probe als auch das Kontroll-Tau auf ein Polyacrylamid-Gel auf, um die Proteine zu trennen. Phosphoryliertes Tau bewegt sich auf dem Gel langsamer als nicht-phosphoryliertes Tau-Protein. Die Proteinprobe wird auf eine geeignete Membran elektrobtupfert und Primärantikörper hinzugefügt, die sowohl phosphoryliertem als auch normalem Tau entsprechen.

Inkubieren Sie den Blot über Nacht. Behandeln Sie den Blot mit einem Reporterenzym-konjugi