CTC-Isolierung aus einer Vollblutprobe: Eine Methode zur Gewinnung von CTCs aus dem Modell des murinen Darmkrebses

- Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind die Krebszellen, die aus dem Primärtumor stammen und in den Blutkreislauf gelangen. Die meisten CTCs können im Blutkreislauf überleben, ohne sich an der Oberfläche festzusetzen; Daher können wir sie bei den meisten Krebspatienten direkt aus dem Blut nachweisen.

CTCs im Blut können auf die Ausbreitung des Tumors im Körper hinweisen, daher hilft ihre Identifizierung, das Fortschreiten des Krebses zu verstehen. Beginnen Sie mit der Entnahme eines anästhesierten Darmkrebs-Mausmodells und gewinnen Sie Blut durch Herzpunktion. Übertragen Sie das Blut in ein konisches Röhrchen mit Dichtegradientenmedium und zentrifugieren Sie, um die Blutbestandteile zu trennen.

Entsorgen Sie die oberste Schicht mit Plasma und sammeln Sie die an der Grenzfläche vorhandene mononukleäre Blutzellfraktion (PBMC) in einem separaten Röhrchen. Fügen Sie als Nächstes den Anti-EpCAM-Antikörper zu PBMC-Zellen hinzu und beobachten Sie ihn unter einem Fluoreszenzmikroskop. Zirkulierende CTCs exprimieren einen Zellmarker, der als Epithelial Cell Adhesion Molecule oder EpCAM bekannt ist. Daher können Anti-EpCAM-Antikörper helfen, EpCAM-positive CTCs zu identifizieren.

Sammeln Sie die CTCs und speichern Sie sie für weitere nachgelagerte Analysen. Im folgenden Protokoll werden wir die EpCAM-exprimierenden CTCs aus der peripheren mononukleären Zellfraktion des Blutes des Darmkrebs-Mausmodells identifizieren.

- Um die zirkulierenden Tumorzellen am entsprechenden experimentellen Endpunkt zu isolieren, füllen Sie 15 Milliliter konische Röhrchen mit 5 Millilitern Dichtegradientenmedium pro Röhrchen und überführen Sie vorsichtig Vollblutproben von tumortragenden Tieren auf die Dichtegradientenschichten.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und bergen Sie vorsichtig die Grenzfläche, die die mononukleären Zellen enthält. Pipettieren Sie die mononukleären Zellen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen für eine zweite Zentrifugation, gefolgt von zwei Waschgängen in PBS. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS, ergänzt mit EDTA, und fügen Sie jeder Probe vier Mikroliter Anti-EpCAM-Antikörper für eine 20-minütige Inkubation auf Eis im Dunkeln hinzu.

Als nächstes zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen etwa 1 Zentimeter großen Kreis in einer sterilen 6 Zentimeter großen Petrischale pro Probe und fügen Sie jedem Kreis 700 Mikroliter Picking-Puffer hinzu, gefolgt von 50 Mikrolitern Zellsuspension. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Dichte der Zellen zu überprüfen, und lassen Sie die Proben etwa fünf Minuten lang absetzen. Untersuchen Sie dann den Zelltropfen auf EpCAM-Positivität und übertragen Sie mit dem Mikromanipulator die interessierenden Zellen in 50 Mikroliter des entsprechenden Puffers für die beabsichtigte nachfolgende nachgelagerte Analyse.