Zytoskelett und fokaler Adhäsionsorganisationsassay: Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung auf Substraten

- Die Substratmorphologie hat einen großen Einfluss auf das Verhalten und die Metastasierungsreaktionen von Krebszellen. Ein dynamisches Netzwerk aus Aktin-Zytoskelett bietet den Zellen strukturelle Unterstützung und vermittelt die Zellbewegung. Große membranassoziierte Proteinkomplexe, sogenannte fokale Adhäsionen, verbinden das Zytoskelett mit der extrazellulären Matrix und erleichtern so die Zellausbreitung.

Um mit der Färbung zu beginnen, nehmen Sie eine Krebszellkultur und behandeln Sie sie mit Paraformaldehyd, um die Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren. Inkubieren Sie nun die Zellen mit einem Signalverstärker-Reagenz, das Proteine enthält, um die Zellen darauf vorzubereiten, die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Fügen Sie Anti-Vinculin-Primärantikörper hinzu, die an Vinculin, eines der Proteine innerhalb des fokalen Adhäsionskomplexes, binden.

Als nächstes inkubieren Sie die Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoffkonjugierten Sekundärantikörper, der auf den Primärantikörper abzielt. Behandeln Sie die Zellen schließlich mit fluoreszierend markierten Phalloidin-Konjugaten, die selektiv an Aktinfilamente des Zytoskeletts binden. Beobachten Sie die Zellen unter einem konfokal