Zytoskelett und fokaler Adhäsionsorganisationsassay: Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung auf Substraten

- Die Substratmorphologie hat einen großen Einfluss auf das Verhalten und die Metastasierungsreaktionen von Krebszellen. Ein dynamisches Netzwerk aus Aktin-Zytoskelett bietet den Zellen strukturelle Unterstützung und vermittelt die Zellbewegung. Große membranassoziierte Proteinkomplexe, sogenannte fokale Adhäsionen, verbinden das Zytoskelett mit der extrazellulären Matrix und erleichtern so die Zellausbreitung.

Um mit der Färbung zu beginnen, nehmen Sie eine Krebszellkultur und behandeln Sie sie mit Paraformaldehyd, um die Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren. Inkubieren Sie nun die Zellen mit einem Signalverstärker-Reagenz, das Proteine enthält, um die Zellen darauf vorzubereiten, die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Fügen Sie Anti-Vinculin-Primärantikörper hinzu, die an Vinculin, eines der Proteine innerhalb des fokalen Adhäsionskomplexes, binden.

Als nächstes inkubieren Sie die Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoffkonjugierten Sekundärantikörper, der auf den Primärantikörper abzielt. Behandeln Sie die Zellen schließlich mit fluoreszierend markierten Phalloidin-Konjugaten, die selektiv an Aktinfilamente des Zytoskeletts binden. Beobachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, um ihre Fluoreszenzsignale zu untersuchen.

Zellen mit gut verteilter Morphologie weisen definierte Aktinfasern auf und weisen ausgeprägte und längliche Vinculin-haltige fokale Adhäsionen auf. Umgekehrt besitzen schlecht verteilte Zellen keine definierten Aktinfilamente, sondern zeigen punktuelle Vinculin-haltige fokale Adhäsionen. Im folgenden Protokoll werden wir einen Immunfluoreszenz-Assay zur Untersuchung des Zytoskeletts und der fokalen Adhäsionsorganisation in primären Dickdarmkrebszellen demonstrieren.

- Nehmen Sie die zu immunfärbenden Substrate auf die laminare Haube und entfernen Sie die Nährmedien. Spülen Sie dann die Substrate mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fixieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd in PBS. Waschen Sie die Substrate insgesamt dreimal fünf Minuten lang mit PBS. Inkubieren Sie dann die Substrate 30 Minuten lang mit 500 Mikrolitern Signalverstärker, bevor Sie sie mit PBS spülen.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit monoklonalen Anti-Vinculin-Antikörpern in einer Verdünnung von 1 bis 250 in PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Substrate insgesamt dreimal fünf Minuten lang mit PBS. Inkubieren Sie die Proben mit einem Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG in einer Verdünnung von 1 bis 200 in PBS bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Waschen Sie dann die Substrate erneut fünf Minuten lang insgesamt dreimal mit PBS.

Um die F-Aktin-Struktur sichtbar zu machen, inkubieren Sie die Zellen mit Tetramethylrhodamin-Phalloidin-Konjugaten in einer Konzentration von 50 Mikrolitern pro Milliliter für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Substrate erneut wie zuvor. Fahren Sie schließlich mit der Abbildung der Proben mit einem konfokalen Scanning-Lasermikroskop fort.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.