Name: Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Lernen Sie die Kultur embryonaler Mäuselungen zur Untersuchung epithelial-mesenchymaler Interaktionen und Verzweigungsmechanismen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung von Wachstumsänderungen unter spezifischen Behandlungen.

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Diese Arbeit wurde durch die Saban Research Institute Pre-Doc-Award (PMDM) unterstützt und von NIH RO1 HL75773 (DW).

Orgel Kultur ist eine sehr nützliche und vielseitige Technik zur Gen-und Proteinexpression zu untersuchen. Diese ex vivo Kultur Methoden können als Vor-oder in Ergänzung zu den in-vivo-Studien verwendet werden. 1. Embryonale Lung Isolation <ol><li> Timed-trächtigen Mäusen auf postcoitum Tag 11,5 oder 12,5 (E11.5-12.5) von CO 2 Narkose nach dem NIH und OLAW Richtlinien geopfert. Das Tier ist in einer Kammer platziert und 100% CO 2 wird eingeführt. Nachdem das Tier bewusstlos ist der CO 2-Strom wird erhöht. Klinische Tod des Tieres muss gewährleistet sein. </li><li> Alle folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank abgeschlossen sein. Die Gebärmutter ist von der trächtigen Weibchen entfernt. Zum Entfernen der Gebärmutter aus dem Tierreich sind die trächtigen Weibchen auf den Rücken gelegt und versprüht mit 70% Ethanol. Ein Schnitt in der Bauchdecke, und die Haut wird durch Ziehen der Haut nach oben, während das Tier Hinterbeine entfernt. Die Bauchhöhle wird geöffnet und die Gebärmutter ist aus dem Tier entfernt. </li><li> Das Blut wird durch Platzierung der Gebärmutter in einer 50 ml konische Röhrchen mit kaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt gespült, und das Rohr ist leicht für 2 Minuten rockten. </li><li> Die Gebärmutter wird dann in einer Petrischale unter dem stereoskopischen Präpariermikroskop gelegt, und die Embryonen aus der Gebärmutter durch Einschneiden der Gebärmutterwand mit Feder Schere freigegeben. Die Embryonen werden geerntet mit einem perforierten Löffel, und auf Eis in eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Unter dem stereoskopischen Präpariermikroskop, sind embryonale Lunge eins nach dem anderen in eine Petrischale mit kaltem HBSS (Abbildung 1) zerlegt. </li><li> Die isolierten embryonalen Lunge ist auf Eis in eine Petrischale mit HBSS mit einer sterilen Transferpipette platziert. </li></ol> 2. Embryonale Lung Kultur <ol><li> 500 Mikroliter bis 1 Milliliter pro Vertiefung D-MEM/F-12 mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin ergänzt ist in einem Nunclon Polystyrol Gericht aufgenommen. </li><li> Ein Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran ist auf der Oberseite der Medien gelegt. Wenn die Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran auf der Oberseite des Media platziert wird, stellen Sie sicher, dass die glänzende Seite gegen die Medien und raue Seite nach oben zeigt ist. </li><li> Ein seziert embryonalen Lunge ist auf der Oberseite des Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran mit einer sterilen Transferpipette platziert. </li><li> Die embryonalen Lungen-Position wird mit Hilfe der Zange. Embryonale Lunge auf dem Filter gesetzt haben sollte eine intakte Luftröhre und ihre Luftröhre mit einer geraden Position gebracht werden, so dass alle Lunge zu den gleichen Innendruck haben. </li><li> Die Nunclon Polystyrol Gericht ist für die gewünschte Kultur Uhrzeit in eine Zelle Inkubator (Abbildung 2) übertragen. </li></ol> 3. Materialien 1. Embryonale Whole Lung Isolation <ol><li> Timed-schwanger (C57BL6 Wildtyp oder transgene) Mäuse auf postcoitum Tag 11,5 bis 13,5 (E11.5-13.5) geopfert werden. </li><li> Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), flüssig, ohne Calciumchlorid, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat. (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Bewahren Sie die HBSS bei Raumtemperatur und bei 4 ° C nach dem Öffnen. Aliquotieren und speichern Sie die Penicillin-Streptomycin bei -20 ° C. </li><li> Stereoscopic Präpariermikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland). </li><li> Dissection-Tools einschließlich Dumont Pinzetten, Fine Iris Schere (gerade), Noyes Frühjahr Schere und Moria ® Löffel (perforiert) (Fine Science Tools, Foster City, CA). </li></ol> 2. Embryonale ganze Lunge Kultur <ol><li> Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1x), flüssig, noch 1:1 L-Glutamin, aber keine HEPES-Puffer. (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Halten Sie die DMEM/F-12 Flasche weg vom Licht (z. B. durch Aluminiumfolie abgedeckt) und lagern bei 4 ° C. Aliquotieren und speichern Sie die Penicillin-Streptomycin bei -20 ° C. </li><li> Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran, 8,0-m, 13 mm (Whatman Nuclepore Track-Etch-Membran (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Nunclon Polystyrol Schüssel mit Deckel, 4 Vertiefungen (Rochester, NY). </li><li> Einweg Transferpipetten, sterile (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Präparation E12 embryonalen Lunge. (A) E12.5 ganze Embryo von der rechten Seite angezeigt. (B) mit der rechten Vorderbein aus dem Embryo entfernt worden ist. (C) Pinzetten von der linken Hand des Embryos stetig in die Schüssel gehalten. Die Pfeile zeigen Plan der Dissektion (D) Embryonale Lunge liegt hinter dem Herzen (entfernt) Und vor der Wirbelsäule. Diese Abbildung zeigt die Lunge nach Haut-und Herz Entfernung. (E) Pharynx Entfernung Trennung der intakten Lunge ermöglicht aus dem Embryo. (F) Überflüssige pharyngeale Gewebe und Speiseröhre wurden abgeschnitten. Dissected E12.5 embryonalen Lunge mit intakten Luftröhre und Kehlkopf wird angezeigt. (Cr) Cranial Lappen, (Med) Medial Lappen, (Ca) Schwanzflossenlappen, (Acc) Zubehör Lappen, (Le) linken Lappen. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. FGF9 induziert Erweiterung des Mesenchyms und der Dilatation des Epithels in der Lunge in vitro gezüchtet. (AC) E12.5 Lunge für 48 Stunden in Abwesenheit von FGF9 angebaut wird. Notieren Sie sich die Zunahme der Verzweigung. (DF) E12.5 Lunge für 48 Stunden in Anwesenheit von FGF9 gewachsen. Beachten Sie die Erweiterung des Epithel und Mesenchym bereits nach 24 Stunden Kultur (E). Nach 48 Stunden (F), ist die Wirkung auf das Epithel noch stärker ausgeprägt. Maßstab: AF 400 um 4. Der vollständige Text Protokoll für diesen experimentellen Ansatz ist in <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">Springer Protocols</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

embryonalen maus-lung kultur, a-system, die molekularen mechanismen des branching bewerten

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung ursprüngliche Spezifikation sowie Verzweigung Morphogenese und die Bildung von verschiedenen Lungenerkrankungen Zelllinien erfordert eine spezifische Wechselwirkung der Lunge Entoderm mit seinen umliegenden Mesenchym und Mesothel. Lung Mesenchym hat sich gezeigt, dass die Quelle der induktive Signale für Lungen-Verzweigung Morphogenese werden. Epithelial-mesenchymale-mesothelial Wechselwirkungen sind auch entscheidend für die embryonale Lunge Morphogenese. Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann (in der Abwesenheit der Mutter beeinflusst und die Durchblutung). Noch wichtiger ist diese Technik kann leicht in einer serumless, chemisch definierten Kulturmedien erfolgen. Gewinn und Verlust der Funktion kann mit Hilfe exprimierten Proteine, rekombinante virale Vektoren und / oder Analyse von transgenen Maus-Stämme, Antisense-RNA, sowie RNA-Interferenz-Gen Knockdown werden.

Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann.

Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Die primordiale Spezifikation der Lunge sowie die Verzweigungsmorphogenese und die Bildung verschiedener pulmonaler Zelllinien erfordern eine spezifische Interaktion von ...

In diesem Video wird eine Methode zur Dissektion und Kultur embryonaler Mauslungen demonstriert. Das Verfahren beginnt mit der Gewinnung von Embryonen am Tag E 11,5 oder E 12,5. Anschließend werden die Embryonen geöffnet und die Lungen entnommen.Die Lungen werden anschließend in einer Flüssig-Luft-Grenzfläche platziert und nach der Kultivierung inkubiert. Veränderungen im Wachstum und in der Verzweigung des Mesenchyms und des Epithels der embryonalen Lunge als Reaktion auf spezifische Behandlungen können mithilfe eines Stereomikroskops beobachtet werden. Hallo, ich bin David War Burton.Ich leite das Programm für Entwicklungsbiologie und regenerative Medizin am Ban Research Institute Children's Hospital in Los Angeles. Und ich bin Jan Carro, ein Senior-Postdoktorand im Labor von Dr. War Burton. Heute werden wir Ihnen eine Technik zur Isolierung embryonaler Mauslungen und deren Kultivierung in Organ-Kultur vorstellen.Diese Technik hat sich aus der ursprünglichen Beschreibung von Tina Jaco Halkin und Pablo entwickelt, die sie vor etwa 20 Jahren an der Zahnmedizinischen Fakultät der USC vorstellten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Verzweigungsmorphogenese von Lämmern zu untersuchen. Beginnen wir also.Am 11,5. oder 12,5. Tag nach der Befruchtung stellen Sie eine mit Kohlendioxid euthanasierte, zeitlich befruchtete Maus unter einer sterilen Haube auf den Rücken. Benetzen Sie sie mit 70 %igem Ethanol. Führen Sie einen Schnitt im Bauchbereich durch.Danach, während man die Hinterbeine des Tieres hält, die Haut durch Ziehen nach oben entfernen. Die Bauchhöhle öffnen und die Gebärmutter entfernen. Die Gebärmutter in ein 50-Milliliter-Konischglas füllen, das mit kalter Hanks‘ abgestimmter Salzlösung oder HBSS gefüllt ist, und sanft zwei Minuten lang schwenken, um das Blut abzuwaschen.Anschließend wird der Uterus unter einem stereoskopischen Auflichtmikroskop in eine Petrischale überführt. Mit Feder-Scheren schneiden Sie die Uteruswand auf, um die Embryonen freizugeben. Danach werden die Embryonen mit einem perforierten Löffel gesammelt und in eine Petrischale mit HBSS gegeben, die auf Eis gestellt wird.Setzen Sie die Arbeit unter dem stereoskopischen Auflichtmikroskop fort und beginnen Sie mit der Dissektion der embryonalen Lungen. Legen Sie dazu das Embryo auf die linke Seite. Entfernen Sie mit einer Pinzette die rechte Vordergliedmaße, wobei Sie die Haltepinzette in der linken Hand halten.Schneiden Sie den Embryo ab der Gliedmaßenöffnung auf und entfernen Sie die Haut. Dieser Schritt ermöglicht es Ihnen, die inneren Organe zu sehen und Herz und Lunge für den folgenden Schritt zu lokalisieren. Entfernen Sie das Herz.Die embryonalen Lungen befinden sich hinter dem Herzen und vor der Wirbelsäule. Danach trennen Sie die intakte Lunge vom Embryo. Anschließend entfernen Sie überflüssiges Gewebe und die Speiseröhre.Nachdem die Lungen entfernt wurden, überführen Sie sie mithilfe einer sterilen Transferpipette in eine Petrischale mit kaltem HBSS auf Eis. Geben Sie in jedes Loch einer nicht-klonierten Delta-Polystyrolschale 0,5 bis ein Milliliter D-M-E-M-F 12, ergänzt mit 50 Einheiten pro Milliliter Penicillin-Streptomycin. Legen Sie anschließend eine Nucleo-Polycarbonat-Track-Etch-Membran mit der glänzenden Seite nach unten und der rauen Seite nach oben auf das Medium.Platzieren Sie mit einer sterilen Transferpipette eine dissezierte embryonale Lunge auf der Nuklo-Polycarbonat-Track-Etch-Membran. Passen Sie unter dem Stereomikroskop die Position der embryonalen Lunge an. Die embryonale Lunge sollte eine intakte Luftröhre haben, die gerade positioniert ist, wie hier gezeigt. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Lungen den gleichen Innendruck haben; überführen Sie die Petrischale in einen Zellkulturschrank und kultivieren Sie sie für die gewünschte Zeit. Hier wurden Lungen von Embryonen im Stadium E 12,5 in Gegenwart oder Abwesenheit von FGF neun kultiviert. FGF neun ist ein Mitglied der Familie der fibroblastären Wachstumsfaktoren, das die Ausdehnung des Mesenchyms und die Dilatation des Epithels in 48 Stunden lang in vitro kultivierten Lungen induziert.Bei Abwesenheit von FGF9 wird eine vermehrte Verzweigung beobachtet. Diese Bilder sind Fotografien der embryonalen Lunge, die unter einem Stereomikroskop aufgenommen wurden. Im Gegensatz dazu weisen Lungen, die 48 Stunden in Gegenwart von FGF9 kultiviert wurden, ein dilatiertes Epithel und Mechy auf.Nach 24 Stunden Kultur. Nach 48 Stunden ist der Effekt auf das Epithel noch deutlicher ausgeprägt. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Organkulturen aus embryonaler Mauslunge herstellt.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Lunge so schnell wie möglich aus dem Embryo zu entfernen, um das Gewebeverderben zu verringern. Vielen Dank fürs Zuschauen. Wir hoffen, dass Sie diese Technik als nützlich empfinden werden.Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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