Keratinozytenisolierung in der menschlichen Haut: Eine Methode zur Kultivierung primärer Keratinozyten aus Hautproben

- Keratinozyten sind die prominentesten Zellen in der Epidermis oder der äußersten Schicht der Haut. Sie ordnen sich in mehreren Schichten über der Dermis an und sind mit verschiedenen anderen Zelltypen wie Melanozyten, dendritischen Zellen und Merkelzellen assoziiert.

Um Keratinozyten zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme des epidermalen Gewebes aus der menschlichen Haut. Anschließend mit einem enzymatischen Verdauungspuffer behandeln. Enzyme im Puffer bauen die im Epidermisgewebe vorhandenen Proteine der extrazellulären Matrix ab und initiieren so die Zelldissoziation. Fügen Sie nun ein geeignetes Medium hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe mechanisch.

Um die dissoziierten Zellen in Suspension freizusetzen, filtrieren Sie die epidermale Zellsuspension durch ein Sieb, um Zellklumpen oder Ablagerungen zu entfernen. Zentrifugieren Sie, um die Epidermiszellen zu pelletieren und sie vom enzymhaltigen Überstand zu trennen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit einem bevorzugten Keratinozyten-Wachstumsmedium. Kultivieren Sie die Zellen für die gewünschte Dauer.

Während der Kultur bereichern die optimierten Medien die Expansion der Keratinozyten, indem sie ihr selektives Wachstum gegenüber den anderen epidermalen Zelltypen fördern. Im folgenden Protokoll zeigen wir die Isolierung von Keratinozyten aus adultem menschlichem Hautgewebe.

- Sammeln Sie 10 Zentimeter x 15 Zentimeter große Hautproben von gesunden erwachsenen Freiwilligen, die sich einer plastischen Operation unterziehen. Halten Sie die Haut kühl, indem Sie die Hautproben in einer Styroporbox transportieren, die ein Kühlelement enthält. Lagern Sie die Hautprobe bei Bedarf bei 4 Grad Celsius über Nacht. Entferne mit einer sterilisierten Schere, einem Skalpell und einer Pinzette das Fett unter der Hautpartie.

Schnallen Sie dann mit Nadeln den Hautabschnitt auf einer sterilen Abdeckung auf einer Platte aus. Reinigen Sie die Haut mit einem trockenen, sterilisierten Mullkissen. Anschließend 70% Ethanol auf ein sterilisiertes Mullkissen auftragen. Schneiden Sie anschließend mit einem Fußhobel die obere Epidermisschicht des Hautabschnitts ab und geben Sie sie in eine 9 Zentimeter große Petrischale.

Geben Sie dann sofort 25 Milliliter der zuvor vorbereiteten DPBS/Trypsin/Glukoselösung in die Petrischale. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie mit einer Pipette die DPBS/Trypsin/Glukoselösung aus der Petrischale und fügen Sie 10 Milliliter RPMI-1640 plus 2 % FBS hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren.

Geben Sie nun mit zwei Pinzetten die Epidermiszellen in das Medium ab, indem Sie sowohl das epidermale als auch das dermale Kompartiment der Hautpartien sanft abkratzen und bewegen. Die epidermale Zellsuspension wird durch einen Metallfilter filtriert und das Filtrat in ein 50-Milliliter-Röhrchen abgefüllt. Die restlichen Hautabschnitte in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern RPMI-1640 ohne FBS geben und 10 Sekunden lang vortexen.

Filtern Sie diese Suspension durch den Metallfilter in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das die epidermale Zellsuspension enthält. Fügen Sie dann DPBS zu einem Gesamtvolumen von 50 Millilitern hinzu. Die Zellsuspension wird bei 450 x g bei Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das epidermale Zellpellet je nach Größe des Zellpellets in etwa 10 Millilitern mit 37 Grad Celsius KSFM.

Zählen Sie die Zellen mit der Trypanblau-Färbemethode unter dem Mikroskop. Dann auf jeden 75 Quadratzentimeter großen Kulturkolben 8 mal 10 auf die sechste Zelle zusammen mit 12 Millilitern 37 Grad Celsius KSFM übertragen. Schütteln Sie die Kulturflaschen vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Keratinozyten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂. Wechseln Sie das Medium nach zwei Tagen und dann 3 Mal wöchentlich.