Rekombinante Virionenpräparation des Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV): Eine Technik zur Herstellung von rekombinantem MCPyV-Virion mit hohem Titer

- Das Merkelzell-Polyomavirus oder MCPyV ist ein doppelsträngiges DNA-Onkovirus mit einem zirkulären Genom, das das Merkelzellkarzinom, eine Art von Hautkrebs, verursacht. Um MCPyV-Virionen herzustellen, wird zunächst eine adhärente Kultur von Verpackungszellen mit einem Cocktail behandelt, der ein Transfektionsmittel, das virale Genom und zwei Expressionsplasmide enthält, die für Proteine kodieren, die für die Förderung der viralen Replikation erforderlich sind.

Während der Inkubation bildet das Transfektionsreagenz mit den Plasmiden Lypoplexe, die deren Abgabe in die Verpackungszellen erleichtern. Im Zellkern angekommen, ermöglicht die Zellmaschinerie die Expression der Virus- und Plasmidgenome. Die Expressionsplasmide kodieren für Proteine des Großtumorantigens und des Kleintumorantigens. Diese Proteine wandern in den Zellkern und treiben die virale DNA-Replikation voran. Anschließend kodiert das virale Genom für strukturelle Kapsidproteine. Diese Proteine wandern in den Zellkern und helfen beim Zusammenbau rekombinanter Virionen.

Ernten Sie als Nächstes die kultivierten Zellen. Behandeln Sie sie mit einer Lösung, die Reinigungsmittel und DNase enthält. Das Detergens lysiert die Zellen, um die Viren freizusetzen. DNase baut jegliche freie Plasmid-DNA aus der Suspension ab. Zentrifuge, um zelluläre Trümmer im Pellet zu trennen. Laden Sie den virushaltigen Überstand in ein Röhrchen, das ein geeignetes Dichtegradientenmedium trägt. Zentrifuge, um konzentrierte virionenreiche Fraktionen innerhalb des Gradientenmediums zu erhalten.

Im folgenden Protokoll zeigen wir die Herstellung von hochtitern rekombinanten MCPyV-Virionen unter Verwendung von 293TT-Zellen.

- Am späten Nachmittag oder Abend 6 Millionen 293TT-28-Zellen in eine 10 Zentimeter große Schale mit zugesetztem DMEM-Medium aussäen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Stellen Sie am nächsten Morgen sicher, dass die Zellen zu etwa 50 % zusammenfließen. Transfizieren Sie die Zellen dann mit 66 Mikrolitern Transfektionsreagenz, 12 Mikrogramm religiertem MCPyV-Isolat R17b-DNA, 8,4 Mikrogramm ST-Expressionsplasmid pMtB und 9,6 Mikrogramm LT-Expressionsplasmid pADL. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Am nächsten Tag, wenn die transfizierten Zellen fast konfluent sind, trypsinisieren Sie die Zellen und übertragen Sie sie zur weiteren Expansion in eine 15-Zentimeter-Schale. Wenn diese Schale fast zusammenfließt, überführen Sie die Zellen in drei neue 15-Zentimeter-Schalen. Wenn diese neuen Schalen fast zusammenfließen, ernten Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bei 180 x g bei Raumtemperatur 5 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie 1 Zellvolumen DPBS-Mg hinzu.

Fügen Sie 25 mikromolare Ammoniumsulfate hinzu, gefolgt von 0,5 % Triton X-100, 0,1 % Benzonase und 0,1 % einer ATP-abhängigen DNase. Gut mischen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Mischung 15 Minuten auf Eis abkühlen lassen. Fügen Sie als nächstes 0,17 Volumen Natriumchlorid hinzu. Mischen und weitere 15 Minuten auf Eis inkubieren. Bei 12000 x g bei 4 Grad Celsius 10 Minuten zentrifugieren. Wenn der Überstand nicht klar ist, das Röhrchen vorsichtig umdrehen und die Zentrifugation wiederholen.

Übertragen Sie danach den Überstand in ein neues Röhrchen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Volumen DBPS, das mit 0,8 Mol Natriumchlorid ergänzt wird. Bei 12000 x g bei 4 Grad Celsius 10 Minuten zentrifugieren. Wenn der Überstand nicht klar ist, das Röhrchen vorsichtig umdrehen und die Zentrifugation wiederholen. Die beiden Überstände vermischen und erneut bei 12000 x g bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.

Verwenden Sie dann eine Pipette, um Gradienten von Iodoxonal in dünnwandige 5-Milliliter-Polyallomerröhrchen abzugeben, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie 3 Milliliter des geklärten, virushaltigen Überstands auf den vorbereiteten iodixonalen Gradienten. Zentrifugieren Sie mit einem SW55ti-Rotor bei 234.000 x g und 16 Grad Celsius für 3,5 Stunden, wobei Sie darauf achten, die Beschleunigung und Verzögerung auf langsam einzustellen. Nach Abschluss der Ultrazentrifugation werden 12 Fraktionen in silikonisierten Röhrchen gesammelt.