Genetische Modifikation primärer humaner Keratinozyten: Eine Methode zur genetischen Manipulation von Keratinozyten mit rekombinanten Retroviren

- Keratinozyten sind der prominenteste Zelltyp, der in der Epidermis oder der äußersten Hautschicht vorkommt. Um Keratinozyten genetisch zu verändern, beginnen Sie mit einer Kultur retroviraler Verpackung von Phönixzellen. Anschließend wird ein Gemisch mit retroviralen Vektoren, die das interessierende Gen tragen, und einem Transfektionsreagenz hinzugefügt. Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Zeitdauer.

Das Transfektionsreagenz erleichtert die Abgabe von viralem Erbgut in die Verpackungszellen. Diese speziell entwickelten Zellen kodieren Proteine, die für die Produktion retroviraler Kapside erforderlich sind, und fördern die Verpackung von retroviraler Vektor-RNA, die das gewünschte Gen trägt. Nach dem Verpacken verlassen reife Viren die Zellen in das Medium. Übertragen Sie nun das virussuspendierte Medium in eine frische Kulturschale mit primären Keratinozyten. Ergänzen Sie die Kultur mit einer gewünschten kationischen Polymerlösung.

Das kationische Polymer neutralisiert die negativen Ladungen auf den Virus- und Keratinozytenmembranen und erhöht so die Effizienz der viralen Fusion mit der Zelloberfläche. Bei der Fusion gibt das Virus seine RNA an das Zytoplasma der Zelle