Genetische Modifikation primärer humaner Keratinozyten: Eine Methode zur genetischen Manipulation von Keratinozyten mit rekombinanten Retroviren

- Keratinozyten sind der prominenteste Zelltyp, der in der Epidermis oder der äußersten Hautschicht vorkommt. Um Keratinozyten genetisch zu verändern, beginnen Sie mit einer Kultur retroviraler Verpackung von Phönixzellen. Anschließend wird ein Gemisch mit retroviralen Vektoren, die das interessierende Gen tragen, und einem Transfektionsreagenz hinzugefügt. Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Zeitdauer.

Das Transfektionsreagenz erleichtert die Abgabe von viralem Erbgut in die Verpackungszellen. Diese speziell entwickelten Zellen kodieren Proteine, die für die Produktion retroviraler Kapside erforderlich sind, und fördern die Verpackung von retroviraler Vektor-RNA, die das gewünschte Gen trägt. Nach dem Verpacken verlassen reife Viren die Zellen in das Medium. Übertragen Sie nun das virussuspendierte Medium in eine frische Kulturschale mit primären Keratinozyten. Ergänzen Sie die Kultur mit einer gewünschten kationischen Polymerlösung.

Das kationische Polymer neutralisiert die negativen Ladungen auf den Virus- und Keratinozytenmembranen und erhöht so die Effizienz der viralen Fusion mit der Zelloberfläche. Bei der Fusion gibt das Virus seine RNA an das Zytoplasma der Zelle ab, das sich umgekehrt in doppelsträngige DNA umwandelt. Diese virale DNA dringt in den Zellkern ein und integriert sich mit dem Keratinozytengenom, was zu genetischen Veränderungen führt. Im folgenden Protokoll zeigen wir die genetische Modifikation primärer humaner Keratinozyten mittels retroviraler Transfektion.

- Am Tag vor der Transfektion werden Phönixzellen in vollständigen Medien in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von 800.000 Zellen pro Well ausgesät. Mischen Sie am Tag der Transfektion 6 Mikroliter Transfektionsreagenz mit 100 Mikrolitern DMEM für jede zu transfizierende Vertiefung und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Mischung wird in ein Röhrchen gegeben, das 3 Mikrogramm retroviralen Vektor für jede zu transfizierende Vertiefung enthält, und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie diese gesamte Mischung tropfenweise in jede Vertiefung der Phönixzellen und inkubieren Sie die Zellen über Nacht.

Entfernen Sie am Tag nach der Transfektion das Medium aus den Phönixzellen und fügen Sie 2 Milliliter frisches vollständiges Medium hinzu. Am selben Tag resuspendieren Sie primäre humane Keratinozyten in keratinozytenserumfreiem Medium mit Antibiotika und säen Sie sie in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 75.000 Zellen pro Well.

Am nächsten Tag wird das Medium geerntet, das nun Viruspartikel aus den transfizierten Phönixzellen enthält. Führen Sie das Medium mit einer Spritze durch den 0,45-Mikron-Filter, um alle kontaminierenden Zellen zu entfernen. Geben Sie 5 Mikrogramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid zu dem gefilterten virushaltigen Medium, um den Infektionsprozess zu unterstützen.

Pipettieren Sie dann 2 Milliliter des Virus auf die am Vortag plattierten Keratinozyten. Als nächstes drehen Sie die 6-Well-Platten in einer Zentrifuge bei 200 x g für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen und entsorgen Sie nach dem Schleudern die Virenmedien. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und fügen Sie dann frisches KCSFM hinzu. Infizieren Sie am nächsten Tag dieselbe Charge von Keratinozyten mit dem Virus nach dem gerade gezeigten Verfahren.