miniCoopR-Vektor-basierte Transgenese: Eine Technik zum Screening von Melanom-induzierenden Genen im Zebrafisch-Tumormodell

- Beim Zebrafisch entsteht das Melanom durch die bösartige Umwandlung von Melanozyten - den Melanin-produzierenden Zellen. Um das Auftreten von Melanomen zu untersuchen, verwenden Sie ein melanomanfälliges, melanozytenarmes transgenes Zebrafischmodell. Diesem Modell fehlen Melanozyten aufgrund einer Funktionsverlust-Mutation in seinem Melanozyten-spezifischen Mitfa-Promotor.

Beginnen Sie damit, einen einzelligen Embryo dieses transgenen Modells auf einer Agarplatte zu entnehmen. Injizieren Sie eine Mischung, die einen Transposon-basierten miniCoopR-Vektor und Transposase-Enzym-mRNAs enthält, in den Embryo. Der Vektor enthält eine Genkassette, die ein Promotor-tragendes Mitfa-Minigen umfasst, das an ein Kandidatengen gekoppelt ist, das zwischen zwei Transposon-Elementen eingebettet ist.

Die co-injizierten mRNAs kodieren für Transposase-Proteine. Diese Proteine wirken auf die Transposon-Elemente und katalysieren die Kassettenexzision aus dem miniCoopR-Vektor, gefolgt von dessen Integration in die genomische DNA des Embryos. Anschließend steuert der Kassettenpromotor die Expression sowohl des Mitfa-Gens als auch des Kandidatengens von Interesse.

Das Mitfa-Gen unterstützt die Rettung und Entwicklung von Melanozyten, während das Kandidatengen, wenn es onkogen ist, den Ausbruch von Melanomen induziert. Siebt den entwickelten Zebrafisch. Transgene Fische mit geretteten Melanozyten entwickeln eine Melaninpigmentierung, während Fische mit Melanomen erhabene pigmentierte Läsionen tragen.

Im folgenden Protokoll werden wir das Screening von Melanom-Onset-Modifikatoren mit miniCoopR-Vektoren in transgenen Zebrafisch-Tumormodellen zeigen.

- Um Konstrukte für die Injektion zu generieren, beginnen Sie mit der Erstellung von Gateway-Klonen mit mittlerem Eintritt durch PCR, indem Sie den offenen Leserahmen der interessierenden Gene in voller Länge amplifizieren und zu pDONR221 rekombinieren. Verwenden Sie dann die Multisite-Gateway-Technologie, um den Melanozyten-spezifischen Mitfa-Promotor, das interessierende Gen und das Polyadenylierungssignal in den miniCoopR-Vektor zu rekombinieren, um die interessierenden Gene unter die Kontrolle des mitfa-Promotors zu bringen.

Injizieren Sie 25 Pikogramm jedes Klons zusammen mit 25 Pikogramm Tol2-Transposase-mRNA in einzellige, transgene, dreifach homozygote Zebrafischembryonen. mitfa-BRAF-p53-mutierte Tiere weisen einen Melanozytenmangel auf und neigen zur Transformation und Melanombildung. Zusammen mit dem interessierenden Gen enthält der miniCoopR-Vektor ein rettendes Mitfa-Minigen. Erfolgreich injizierte Tiere entwickeln also gerettete Melanozyten, die das interessierende Gen exprimieren.

Inkubieren Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 Grad Celsius. Entfernen Sie 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) alle toten Embryonen. 72 Stunden nach der Befruchtung wählen Sie mit einem Präpariermikroskop unter Auflicht vor weißem Hintergrund transgene Tiere mit geretteten Melanozyten aus.

Wenn die Tiere 4 Tage nach der Befruchtung erreicht sind, setzen Sie sie in 3-Liter-Tanks in der Aufzuchtstation der Zebrafischanlage um. Im Alter von 2 Monaten wählen Sie die Tiere aus, bei denen mindestens ein Melanozyten-Rettungsbereich größer als 4 Millimeter im Quadrat ist. Untersuchen Sie die ausgewählten Tiere wöchentlich auf das Vorhandensein von Tumoren. Isolieren Sie tumortragende Tiere für Studienzwecke.

Zeichnen Sie melanomfreie Überlebenskurven mit Alter und Wochen auf der Abszisse und prozentuales melanomfreies Überleben auf der Ordinate. Vergleichen Sie Tiere mit Melanozyten, die ein Gen exprimieren, das für die Kontrolle von Tieren, die EGFP in Melanozyten exprimieren, von Interesse ist. Verwenden Sie einen Log-Rank-Test, um zu bestimmen, ob sich die beiden Kurven statistisch unterscheiden.