Subkutaner Transplantationsassay: Eine Methode zur Transplantation von Melanomzellen von einem Spender in ein Empfänger-Zebrafischmodell

- Während des Melanomtransplantationsassays werden Krebszellen von tumortragenden Zebrafischen in ein immungeschwächtes Empfängermodell transplantiert, um die Tumorentwicklung zu untersuchen. Beginnen Sie damit, einen euthanasierten tumortragenden Zebrafisch zu entnehmen und den Tumor chirurgisch aus seinem Körper zu entfernen. Den Tumor in eine Petrischale mit einem geeigneten Puffer geben und in kleine Stücke zerkleinern.

Als nächstes zerreiben Sie die Tumorfragmente mit einer Pipette. Dadurch werden die Tumorstücke in einzelne Zellen zerlegt. Laden Sie nun die Tumorzellsuspension in eine Spritze. Bereiten Sie anschließend einen immungeschwächten Empfänger-Casper-Zebrafisch auf einem Filterpapier vor. Dieser pigmentdefizienten, mutierten Variante des Zebrafisches fehlen Melanozyten und Iridophoren, was sie transparent und vielseitig für Bildgebungs- und Transplantationsexperimente macht.

Als nächstes injizieren Sie die vorgeladene Melanomzellsuspension subkutan in den Bereich über der Bauchhöhle, auf halbem Weg zwischen dem Hinterhirn und der Rückenflosse des Casper-Zebrafisches. Setzen Sie nun den Empfängerfisch ins Wasser und überwachen Sie ihn, um die Tumorentwicklung zu beobachten. Der durchsichtige Körper des Zebrafisches hilft bei der einfachen Visualisierung der entwickelten Tumore.

Im folgenden Protokoll zeigen wir die Transplantation von Melanomzellen von einem transgenen tumortragenden Zebrafischspender in ein immungeschwächtes Empfänger-Casper-Fischmodell.

- Lassen Sie den 2 bis 3 Monate alten Casper-Fisch des Empfängers mit 25 Gy Gammabestrahlung einen Tag vor der Transplantation den Fisch im Fischwasser erholen. Verwenden Sie Tricain, um einen tumortragenden Fisch einzuschläfern. Schneiden Sie den Tumor ab und geben Sie ihn in eine Petrischale mit ca. 5 Millilitern Filter, sterilisiert 0,9x PBS mit 5% FPS. Würfeln Sie den Tumor mit einem Rasiermesser in Lösung.

Bei Raumtemperatur und mit einer P1000-Pipette zerreiben, um einzelne Zellen herzustellen. Erhöhen Sie das Volumen auf 25 Milliliter. Die Lösung wird durch einen 40-Mikrometer-Maschenfilter filtriert und in einer Tischzentrifuge bei 453 rcf 10 Minuten lang geschleudert. Resuspendieren Sie das Pellet in 0,9 % PBS 5 % FBS bis zur gewünschten Konzentration.

Berechnen Sie mit einem Hämozytometer die genaue Zellzahl und verdünnen Sie die Zellsuspension so, dass das endgültige Injektionsvolumen etwa 5 Mikroliter beträgt. Wenn beispielsweise 50.000 Zellen injiziert werden sollen, sollte die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Mikroliter verdünnt werden. Drehen Sie alle paar Minuten auf das Röhrchen mit der Zellsuspension, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern.

Waschen Sie mit 100 % Ethanol und 0,9x PBS eine 26s Gauge (abgeschrägte Spitze) 701 N 10 Mikroliter Hamilton Spritze 2 bis 3 Mal, bevor Sie die Spritze mit 5 Mikrolitern der Zellsuspension beladen. Nachdem Sie den bestrahlten Empfängerfisch in Tricain betäubt haben, legen Sie ihn auf die Seite auf ein feuchtes Kimwipe.

Stabilisieren Sie den Fisch mit einer Hand und führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in einem 45-Grad-Winkel in die Flanke des Fisches oberhalb der Bauchhöhle ein, etwa auf halber Höhe zwischen der hinteren Begrenzung des Hinterhirns und dem inneren Rand der Rückenflosse. Drücken Sie den Kolben vorsichtig nieder. Lassen Sie den Fisch sich in frischem Fischwasser erholen und beobachten Sie den Fisch täglich auf Tumortransplantation. Ist eine Transplantation erfolgt, kann auch ein kontinuierliches Wachstum und eine Krankheitsentwicklung beobachtet werden.