Name: Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Lernen Sie Zeitraffer-Microcinematographie zur Untersuchung von Schwarmverhalten in Myxococcus xanthus-Biofilmen. Diese kostengünstige Methode mit wiederverwendbaren Silikondichtungen liefert reproduzierbare und quantifizierbare Ergebnisse.

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Diese Arbeit wurde ermöglicht durch eine National Science Foundation Career Award (MCB-0746066, Charakterisierung von Transkriptionsaktivatoren dass Emergent Verhalten zu regulieren), um RDW Wir sind dankbar, dass LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, und HG Taylor für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zum Manuskript.

Zubehör benötigt: <ul><li> Klett-Meter </li><li> Pipette und Spitzen </li><li> 2,5 ml Reaktionsgefäße </li><li> Microcentrifuge </li><li> CTTYE Medien: <ul><li> 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% Hefeextrakt (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM-Medien: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarose </li><li> Wasserbad gesetzt, um 55 ° C </li><li> Glasobjektträger </li><li> Große Deckgläser </li><li> 2 x 2 cm, 0,5-mm-dicke Silikon-Gummi-Dichtung (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilm (oder Etikettierung Band) </li><li> Zange </li><li> Kleine Binder Clips </li><li> Micro-Sampling Pipette (Fisher) </li><li> 100 ul Glas Einweg-Spitze (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Teil 1: Cell Preparation Erstellen Sie zunächst eine sterile Umgebung. <ul><li> Saubere Arbeitsbereich, don Handschuhe und Licht-Brenner. </li></ul><ol><li> Starten Sie eine Übernacht-Kultur von Zellen durch Impfen in einen Kolben mit CTTYE Brühe und im Dunkeln inkubiert bei 32 ° C unter kräftigem Rühren. </li><li> Sobald die Kultur erreicht eine Dichte von 5 x 10 8 Zellen / ml, 1 ml Zellen in ein 2,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 2 min bei 16.000 xg (oder max Geschwindigkeit). </li><li> Dekantieren und Überstand verwerfen. </li><li> Wash Zellpellet mit 1 ml TPM (Salz-ausgewogene, nährstoffreiche freien Medien). <ul><li> resuspendieren und vortexen </li></ul></li><li> Re-Pellet-Zellen durch Spinnen für 2 min bei 16.000 xg (oder max Geschwindigkeit). </li><li> Dekantieren und Überstand verwerfen. Entscheidender Schritt </li><li> Komplett neu einzustellen Pellet in 100 ul TPM Medien mit einer Kombination aus Pipettieren und Vortexen. WICHTIG: Dieser Schritt stellt sicher, dass es keine Zellklumpen in die Röhre gelassen. Dies kann eine Weile dauern. </li><li> Stellen Sie die Zellen neben bei Raumtemperatur während der Vorbereitung der Tracking-Assay-Platten. </li></ol> Teil 2: Agar Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie 50 ml der beiden TPM (Assay Medien) und CTTYE (nutritive Disk)-Medien. </li><li> Geben Sie 0,5 g Agarose jedem (Agarose ist weniger als diffraktive Agar). </li><li> Autoklaven sterilisieren. </li><li> Nach der Sterilisation, pflegen die Medien bei 55 ° C in einem Inkubator (oder Wasserbad) beim Bau des Tracking Assayplatte Komplexe. </li></ol> Teil 3: Nutritive Disk-Bau <ol><li> Legen Sie eine sterile 0,5-mm-dicke Silikon-Gummi-Dichtung auf einer Flamme sterilisiert Glasobjektträger und bilden eine kleine, gut. </li><li> Pipette ~ 300 ul der 55 ° C CTTYE media / Agarose in den Brunnen durch die Dichtung auf der Folie erstellt und enthält die Nährstoffe speichern. Die CTTYE media / Agarose sollte Erdhügel auf. </li><li> Legen Sie eine Flamme sterilisiert slide (ohne Dichtung) auf der Oberseite des CTTYE media / Agarose. WICHTIG: Dieses Bild muss sich in einem Winkel zur Blasenbildung zu verhindern eingestellt werden. </li><li> Sobald die Schiene ist vorhanden, klemmen Sie die komplexe zusammen mit Mini-Bindemittel-Clips - auf jeder Seite. </li><li> Legen Sie die abgeschnitten Komplex bei 4 ° C und ermöglichen die CTTYE media / Agarose eingestellt. Dies dauert in der Regel ca. 5 min. </li></ol> Teil 4: Tracking Assay Vorbereitung - Set Up Platte Komplexe Montieren Sie die Komponenten, bereiten Sie das Dia-Komplexe, legen Sie die nutritive Festplatte, gießen Sie die TPM media / Agarose, separate und trocknen Platte Komplexe, Platten-Zellen, und montieren Tracking Assayplatte Komplexe. Montieren Platte komplexe Bauteile <ol><li> Für jedes komplexe, schwer einen Glasobjektträger sterilisiert </li><li> Ein autoklaviert Dichtung am oberen Rand der Folie und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies bildet den Boden des Assays. </li><li> Flamme sterilisieren ein Deckglas und legen Sie es auf einem zweiten Glas Objektträger mit Kennzeichnung Band (oder Parafilm) gewickelt und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies ist als Unterstützung Folie, um das Deckglas vor Rissen zu halten verwendet. Diese bilden die Spitze des Assays. </li><li> Flamme sterilisieren ein Drittel Glasobjektträger und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies wird verwendet, um die Agarose abflachen werden. WICHTIG: Sicherstellen, dass die Dichtungen eine Abdichtung mit dem Glas, indem Sie ihn mit einer Pinzette, da sonst die media / Agarose kann austrocknen. </li></ol> P Spitzen nutritive Festplatte WICHTIG: Schritte 5 bis 10 muss auf einer Folie komplexe zu einem Zeitpunkt erfolgen, da sonst die media / Agarose konnte beginnen sich zu verfestigen, was zu schlechter Bildqualität. <ol start="5"><li> Entfernen Sie die nutritive Festplatte komplexe Form 4 ° C (Schritt 5 von Teil 3) und hebeln auseinander Folien Freilegung der nun verfestigt CTTYE / Agarose. </li><li> Entfernen eines 1 mm Durchmesser "nutritive disk" aus dem CTTYE media / Agarose auch oben mit einem Mikro-Probenahme-Pipette mit einer 100 ul Glas Einweg-Spitze beschrieben und legen Sie sie in die gut von der Dichtung auf das Deckglas (Schritt 3 oben) erstellt . </li></ol> Platten gießen Entscheidender Schritt <ol start="7"><li> Pipette ~ 300 ul der 55 ° C TPM media / Agarose in den Brunnen durch die Dichtung auf dem Deckglas und mit den nahrhaften Festplatte erstellt. Die TPM-media / Agarose sollte Erdhügel auf. Entscheidender Schritt </li><li> Legen Sie die Flamme sterilisiert slide ohne Dichtung (aus Schritt 3) auf der Oberseite des TPM media / Agarose. WICHTIG: Dieses Bild muss sich in einem Winkel zur Blasenbildung zu verhindern eingestellt werden. </li><li> Sobald die Folie (aus Schritt 5) ist vorhanden, klemmen Sie die komplexe zusammen mit Mini-Bindemittel-Clips - auf jeder Seite. </li><li> Legen Sie die abgeschnitten Komplex bei 4 ° C und ermöglichen den Medien / Agarose eingestellt. Dies dauert in der Regel ca. 5 min. </li></ol> Separate und trocken Platten WICHTIG: Um die Medien / Agarose vor dem Austrocknen zu verhindern, die Schritte 11 bis 20 sollten nur auf einer Folie komplexe zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden. WICHTIG: Für beste Ergebnisse, die Schritte 11 bis 13 sollte bei 4 ° C durchgeführt werden <ol start="11"><li> Nachdem die Medien / Agarose gesetzt hat, entfernen Sie das Bindemittel Clips und drücken Sie die Ende des Komplexes um das Band-gehüllt gleiten zu lösen. </li><li> Entfernen Sie das Klebeband umwickelt-Rutsche und legen Sie es auf der Bank zur weiteren Verwendung. Entscheidender Schritt </li><li> Mit einer Pinzette wie ein Keil, separate das Deckglas / Dichtung / media / Agarose-Komplex von der Support-Folie (ohne Dichtung) und entsorgen Sie die Unterstützung gleiten. WICHTIG: Verwenden Sie keine neugierigen Bewegung das Deckglas / Dichtung komplexen trennen. Dies könnte in das Deckglas zu brechen und / oder der Medien / Agarose Festhalten an der Unterstützung Rutsche führen. </li><li> Legen Sie das Deckglas / Dichtung / media / Agarose-Komplex auf dem Band-gehüllt slide (Dichtung nach oben) und entfernen von 4 ° C. Legen Sie diese komplexe neben einem Brenner, damit alle sichtbare Feuchtigkeit aus den neu freigelegten media / Agarose Oberfläche verdunsten - nicht mehr als 1 min. WICHTIG: Lassen Sie sich nicht den Medien / Agarose trocken zu lange, da dies Auswirkungen auf die M. xanthus Schwarmverhalten. </li></ol> Platte Zellen Entscheidender Schritt <ol><li> Nachdem die überschüssige Feuchtigkeit verdunstet ist, Pipette 0,5 ul der konzentrierten Zellen (Schritt 8 aus Teil 1) auf das Medium / Agarose ca. 1 mm von der Nährstoff-Festplatte. WICHTIG: Es ist äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen, indem Sie die Pipette senkrecht nach unten und dann gerade nach oben abgelegt werden. Dies gewährleistet, dass der Schwarm wird kreisförmig sein. WICHTIG: Es ist äußerst wichtig, nicht die Pipettenspitze an die Medien / Agarose berühren. Dies wird eine Depression auf der Oberfläche zu machen und das Verhalten des M. xanthus Schwarm. TIPP: Halten Sie die Pipette vor Annäherung an die Medien / Agarose. Dies ermöglicht einen Rückgang von Zellen auf der Unterseite der Pipettenspitze erscheinen und machen es leichter, die Zellen zu hinterlegen. </li><li> Sobald die Zellen abgeschieden werden, statt sich der Komplex neben dem Brenner, damit die Zelle vor Ort, um zu trocknen - nicht mehr als 20 sek. </li></ol> Assemble-Test <ol><li> Sobald die Zelle vor Ort getrocknet ist, richten Sie die Folie / Dichtung Komplex (aus Schritt 1) ​​mit der Dichtung auf das Deckglas / Dichtung / media / Agarose / Zelle-Komplex (aus Schritt 13) und sanft zusammen drücken, um eine Dichtung zu bilden. Entscheidender Schritt </li><li> Reinigen Sie die Oberflächen der Folie und Deckglas mit einem Kimwipe dem Rückstand durch den Parafilm links entfernen. Der ausgefüllte Test sollte Abbildung 1 ähneln. </li><li> Legen Sie das ausgefüllte Dia-Komplex auf der beheizten Bühne bei 32 ° C gehalten (nach unten rutschen, Deckglas nach oben) unmittelbar nach abwischen (Schritt 15), um Kondensation bilden bildung zu verhindern. Wenn sich Kondensation gebildet hat, lassen Sie schieben komplexen sitzen auf der beheizten Bühne für einige Sekunden vor dem Start der Bildaufnahme-Software. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Ziel (2X, 4X oder 10X). </li></ol> Teil 5: Movie Vorbereitung t "&gt; entscheidender Schritt <ol><li> Schalten Sie die Kamera und Mikroskop, und überprüfen Sie die Lichtverhältnisse (stellen Sie sicher, das Licht nicht zu intensiv). Starten Sie den Computer und öffnen Sie die Bildaufnahme-Programm. </li><li> Klicken Sie auf das Live-Bild-Fenster und Fokus des Mikroskops. Das Bild sollte in etwa dem in Abbildung 3 zu sehen. Beachten Sie die einheitliche Agaroberfläche. </li><li> Starten Erfassen von Bildern. Entscheidender Schritt </li><li> Prüfen Sie die Fokussierung regelmäßig während der ersten Stunde, wie die Medien / Agar neigt sich absetzen was den Fokus auf Drift. </li><li> Saubere Arbeit Bereich. </li><li> Nach der Bildaufnahme beendet ist, erworben Übertragung von Bildern für die Lagerung und zum Abbau der Rutsche Komplex durch Einweichen in 90% Ethanol über Nacht. </li><li> Autoclave Dichtungen für die Wiederverwendung. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Cartoon Illustration der TM Platte komplex. (A) zeigt den prinzipiellen TM Platte Komplex in Explosionsdarstellung und Querschnitt. (B) zeigt die Verwendung von größeren Dichtungen. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Mikroskop-Cluster. Jedes Mikroskop Knoten (kleines Bild) besteht aus einer Nikon E400 Mikroskop, Ziele, einen beheizten Bühne, ein Insight-Kamera und ein Notebook. Jeder Knoten ist vernetzt und verbunden mit einem Master-Controller-Computer. Zwei der Knoten sind mit Fluoreszenz-Funktionen, die der EXFO Lichtquelle und zwei Uniblitz Fensterläden bestehen gesetzt. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. A 20X Bild von Tracking-Test Gerät zum Zeitpunkt = 0 ist. Scale-bar, 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Anpassungsfähigkeit der TM Platte komplex. (A) eine 100x Bild von M. xanthus Gleiten Motilität auf CTTYE in 1,0% Agar. (B) einen 20X Bild von P. aeruginosa Zucken Motilität. (C) einen 20X Bild S. marcescens Schwärmen Motilität. Beide (B) und (C) wurden auf LB in 1,0% Agar untersucht. (D) ein 40X Bild von M. smegmatis Schiebetüren Motilität auf LB in 0,5% Agar. Dieses Bild wurde aufgenommen mit dem alternativen Assaykonfiguration in Abb. 1B. Video 1. Ein Zeitraffer-Video eines Schwarms unterzogen, um die Tracking-Test. Video 2. Ein Zeitraffer-Video eines M. xanthus Schwarm, wo 1% der Zellen sind fluoreszenzmarkierten. Wechselnde Phasen-Kontrast-und Fluoreszenz-Bilder wurden gefangen genommen und überlagert werden, um die Position der fluoreszierenden Zellen innerhalb des Schwarms zu erläutern. Dieses Video wurde auf CTTYE in 1,0% Agar eingefangen. Video 3. Ein Zeitraffer-Video von M. xanthus Gleiten Motilität. Dieses Video wurde auf CTTYE in 1,0% Agar eingefangen. Video 4. Ein Zeitraffer-Video von P. aeruginosa Zucken Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 1,0% Agar eingefangen. Video 5. Ein Zeitraffer-Video von S. marcescens Schwärmen Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 1,0% Agar eingefangen. Video 6. Ein Zeitraffer-Video von M. smegmatis Schiebetüren Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 0,5% Agar mit dem alternativen Assaykonfiguration in Abb. 1B erfasst.

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<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

Zeitraffer-microcinematography (TM) hat sich zu einem Standard-Ansatz zur Untersuchung prokaryotischen Motilität 2-7. Traditionell wird TM mit Filterpapier Dochte, dünne Agar-Pads, oder Agar Platten als Substrate 8-11 durchgeführt. Diese Methoden sind ausreichende und kostengünstige, wenn verwendet, um Bildsequenzen für allgemeine Illustrationen von bakteriellen Bewegung zu erzeugen. Allerdings, wenn Bildsequenzen müssen bei der Erzeugung von reproduzierbaren und quantitativen strengen Daten führen...

<table><tbody><tr><td>1,0 % Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Hefeextrakt</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroproben-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l Einweg-Glaskolben</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 cm, 0,5 mm dicke Silikonkautschukdichtung</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording multizelluläre behavior in myxococcus xanthus biofilme mit zeitraffer-microcinematography

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Ein Schwarm der δ-Proteobakterium Myxococcus xanthus enthält Millionen von Zellen, die als Kollektiv, die Koordination der Bewegung durch eine Reihe von Signalen bis hin zu komplexen, dynamischen Muster als Reaktion auf Umweltreize zu schaffen zu handeln. Diese Muster sind sich selbst organisierende und emergente, sie können nicht durch die Beobachtung des Verhaltens der einzelnen Zellen vorhergesagt werden. Mit einem Zeitraffer-microcinematography Tracking-Assay identifizierten wir eine deutliche emergent Muster in M. xanthus als Chemotaxis, definiert als die gerichtete Bewegung von einem Schwarm eine Nährstoff-Gradienten in Richtung seiner Quelle 1. Um effizient zu charakterisieren Chemotaxis über Zeitraffer-microcinematography, entwickelten wir eine stark modifizierbar Platte Komplex (Abbildung 1) und konstruiert ein Cluster von 8 Mikroskope (Abbildung 2), die jeweils für den Fang von Zeitraffer-Videos. Der Test ist streng genug, um konsistente Replikation von quantifizierbaren Daten zu ermöglichen, und die daraus resultierenden Videos ermöglichen es uns, zu beobachten und zu verfolgen subtile Veränderungen in Schwarmverhalten. Einmal erfasst, sind die Videos auf einer Analyse / Lagerung Computer mit genügend Arbeitsspeicher zur Verarbeitung und Speicherung Tausende von Videos übertragen. Die Flexibilität dieser Einrichtung hat sich bewährt, mehrere Mitglieder der M. xanthus Gemeinschaft.

Zur Untersuchung<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Schwarmverhalten, haben wir ein Zeitraffer-microcinematography Protokoll, das für verschiedene Tests modifiziert werden kann konzipiert. Das Unternehmen beschäftigt Standard Wachstumsbedingungen für die Mikroskopie geeignet und liefert reproduzierbare Ergebnisse durch den Einsatz von kostengünstigen und wiederverwendbaren Silikon-Dichtungen. Wir haben diese Methode verwendet, um vielzelligen Chemotaxis zu quantifizieren.

Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography

Ein Schwarm des $\delta$-Proteobakteriums Myxococcus xanthus besteht aus Millionen von Zellen, die als Kollektiv agieren und ihre Bewegung durch eine Serie von ... koordinieren.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine kostengünstige Zeitraffermikroskopie-Methode zu entwickeln, die streng genug ist, um reproduzierbare und quantifizierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies wird erreicht, indem kostengünstige, wiederverwendbare Silikon-Dichtungen verwendet werden, um Agar-Medienplatten oder Mikroskoppräparate herzustellen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Plattenkombinationen über eine Vielzahl von Medientypen und Agarkonzentrationen hinweg mehr als eine Woche lang ausreichend befeuchtet und belüftet bleiben.Außerdem beschleunigt die Verwendung von acht kostengünstigen Mikroskopen die Datenerfassung, da die Zeitraffermikrofilmaufnahme ein langsamer Prozess ist. Hallo, ich bin Ryan Taylor aus dem Labor von Dr. Roy Welch vom Fachbereich Biologie der Syracuse University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Zeitrafferaufnahmen bakterieller Biofilme in unserem Labor. Mit diesem Verfahren untersuchen wir das vielzellige Verhalten von MTI-Biofilmen.Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, messen Sie die Zelldichte einer Übernachtkultur von Occus sanus mit einem Klotterzähler. Übertragen Sie ein Milliliter der Kultur in ein 2,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, pelletieren, waschen und resuspendieren Sie die Bakterien in TPM-Medium, wie im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Pipettieren und wirbeln Sie, um das Pellet vollständig erneut aufzuschwemmen, was einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Fügen Sie anschließend 0,5 Gramm Aros zu 50 Milliliter TPM hinzu, dem Assay-Medium.Fügen Sie außerdem 0,5 Gramm Aros zu 50 Millilitern C-T-T-Y-E hinzu, dem Nährbodenmedium, das zur Sterilisation autoklaviert wird. Anschließend halten Sie das Medium bei 55 Grad Celsius in einem Inkubator oder Wasserbad. Während Sie den Nachweistest aufbauen.Die Plattenkomplexe werden weiterverarbeitet, um zuerst die nährende Scheibe unter Verwendung des flammensterilisierten Glasmikroskops herzustellen. Legen Sie eine sterile Silikonkautschukdichtung mit einer Dicke von 0,5 Millimetern auf den Objektträger. Pipettieren Sie etwa 300 Mikroliter C TT YE-Medium in die durch die Dichtung auf dem Objektträger gebildete Vertiefung.Das C-T-T-Y-E-Agar sollte aufgehäuft werden, um Flammen zu sterilisieren; danach eine weitere Objektträgerplatte nehmen und sie in einem Winkel auf das C-T-T-Y-E-Agar legen. Das vorsichtige Ablegen des Objektträgers in einem Winkel verhindert die Bildung von Blasen. Sobald der Objektträger richtig positioniert ist, fixieren Sie das Ganze mit kleinen Büroklammern, jeweils eine auf jeder Seite. Stellen Sie den präparierten Komplex bei vier Grad Celsius ab und lassen Sie das C-T-T-Y-E-Medien-Agro erstarren. Dies dauert gewöhnlich etwa fünf Minuten. Sobald das Agro erstarrt ist, können die Plattenkomplexe, die im Tracking-Assay verwendet werden, vorbereitet werden.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Objektträger zur Herstellung der Assay-Komplexe. Für jeden Komplex zwei Glasobjektträger mit der Flamme sterilisieren. Einen Autoklavgummi auf einen der Objektträger legen, um den Boden des Assays zu bilden.Die andere Objektträgerplatte dient zum Andrücken der Agarose und als Trägerplatte. Oben auf dem Test wird ein Deckglas platziert. Wickeln Sie zunächst ein Etikettierband um einen Objektträger, sterilisieren Sie dann das Glasdeckglas durch Ausglühen und legen Sie es auf den umwickelten, sterilisierten Objektträger.Schieben Sie die umwickelten Halterungen nach oben, um die Deckglasabdeckung zu stützen und zu verhindern, dass sie bricht. Legen Sie eine Autoklavierdichtung mit einer Pinzette auf das mit der Flamme sterilisierte Deckglas. Drücken Sie auf die Dichtungen an der unteren Folie und das Deckglas, um sicherzustellen, dass sie eine Abdichtung mit dem Glas bilden. Andernfalls können die Medienagars austrocknen. Stellen Sie die Objektträger-Dichtung und die Abdeckung-Dichtung mit den sterilisierten Seiten nach oben beiseite und arbeiten Sie von nun an immer nur an einem Komplex gleichzeitig, um zu verhindern, dass die Medienagars erstarren, was zu einer schlechten Bildqualität führen würde. Beginnen Sie damit, die Nährscheibe zu platzieren.Entfernen Sie den nutritiven Diskus-Komplex von vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Bindungseclipse und heben Sie die Objektträger vorsichtig an, um die nun erstarrten C-T-T-Y-E-Aros freizulegen, und verwenden Sie dazu eine Mikroprobenpipette mit einer 100-Mikroliter-Glas-Einwegspitze. Entnehmen Sie außerdem einen nutritiven Diskus mit einem Durchmesser von einem Millimeter aus dem C-T-T-Y-E-Medium-Agar und legen Sie ihn in die durch die Dichtung auf dem Deckglas erzeugte Vertiefung.Danach das TPM-Medienagros aus dem Inkubator entnehmen und 300 Mikroliter in den durch die Dichtung auf dem Deckglas gebildeten Brunnen pipettieren, der die Nährscheibe enth&auml;lt. Das TPM-Medienagros sollte sich aufw&ouml;lben, um das T-P-M-S-A-Medienagros zu ebnen. Eines der flammensterilisierten Objekttr&auml;ger ohne Dichtung in einem Winkel auf das TPM-Medienagros legen. Das Platzieren des Objekttr&auml;gers in einem Winkel hilft, die Bildung von Blasen zu verhindern.Befestigen Sie den Komplex mit je einer kleinen Büroklammer auf jeder Seite. Stellen Sie den geklammerten Komplex bei vier Grad Celsius ab und lassen Sie das Kulturmedium erstarren. Dies dauert normalerweise etwa fünf Minuten.Sobald das Medium erstarrt ist, entfernen Sie den Komplex aus vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Büroklammern und drücken Sie das Ende des Komplexes zusammen. Um den mit Klebeband umwickelten Objektträger zu lösen, nehmen Sie diesen ab und legen Sie ihn zur weiteren Verwendung auf den Arbeitsplatz.Dann mit einer Pinzette als Keil verwenden. Das Deckglas-Dichtungsmedium-Agros-Komplex von dem Trägerobjektträger trennen und den Trägerobjektträger entsorgen. Keine Hebelbewegung verwenden, um das Deckglas-Dichtungskomplex zu trennen, da dies zum Brechen des Deckglases und/oder zum Anhaften des Medienarrays an dem Trägerobjektträger führen könnte.Nachdem die Stützplatte entfernt wurde, das Deckglas-Dichtungs-Medium-Array-Komplex mit der Dichtungsseite nach oben auf den mit Klebeband umwickelten Objektträger legen. Dieses Komplex neben einen Brenner stellen, damit die gesamte sichtbare Feuchtigkeit von der neu freigelegten Agaroseoberfläche des Mediums verdunsten kann. Das Medium darf nicht länger als eine Minute austrocknen.Da dies das Schwarmverhalten von M Zant beeinflussen könnte, fahren Sie fort, die Zellen auf dem frisch präparierten Assay-Komplex zu platzieren. Sobald die überschüssige Feuchtigkeit aus dem Deckglas-Dichtungsmittel-Media-Agros-Komplex verdunstet ist, aspirieren Sie 0,5 Mikroliter der konzentrierten Zellen, um sie auf das Medium aufzutragen. Drücken Sie die Pipettenspitze mit Aeros nieder, bevor Sie sich dem Media-Agros nähern.Ein Tropfen mit Zellen erscheint an der Spitze der Pipette, wodurch es leichter ist, die Zellen abzugeben, ohne dass die Spitze das Agar-Medium berührt. Eine Vertiefung auf der Agar-Oberfläche kann das Verhalten des MZ-Schwarmes verändern. Bewegen Sie die Pipette gerade nach unten, um die Zellen etwa einen Millimeter vom eingebetteten nährenden Plättchen entfernt abzugeben.Ziehen Sie die Pipette dann gerade wieder nach oben. Auf diese Weise stellt man sicher, dass der Schwarm kreisförmig ist. Sobald die Zellen aufgetragen sind, stellen Sie das Präparat neben den Brenner, um die Zellenstelle nicht länger als 20 Sekunden trocknen zu lassen.Nach dem Trocknen die Objektträger-Dichtungsanordnung, die die Unterseite des Komplexes bildet, mit der Dichtung auf der Abdeckung ausrichten. Die Dichtung mit dem Zellkulturmedium über dem Zellkomplex, die die Oberseite des Komplexes bildet, vorsichtig aufschieben. Sanft zusammendrücken, um eine Abdichtung zu erzeugen.Reinigen Sie die Oberflächen des Objektträgers unter dem Deckglas mit einem Kim-Wisch, um Rückstände zu entfernen und Kondensation zu verhindern. Platzieren Sie den Objektträger-Deckglas-Komplex unmittelbar nach der Reinigung auf dem beheizten Mikroskopständer, wobei der Objektträger unten und das Deckglas oben liegt. Falls sich Kondensation gebildet hat, lassen Sie den Objektträger-Deckglas-Komplex mehrere Sekunden auf dem beheizten Ständer stehen, bevor Sie die Bildaufnahmesoftware starten.Um den Film vorzubereiten, wählen Sie das geeignete Objektiv am Mikroskop aus, entweder 2x, 4x oder 10x. Schalten Sie die Kamera und das Mikroskop ein und überprüfen Sie die Lichtintensität, um sicherzustellen, dass das Licht nicht zu stark ist. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Bildaufnahmeprogramm.Klicken Sie auf das Live-Bildfenster und fokussieren Sie das Mikroskop. Das Bild erscheint ähnlich wie das hier gezeigte. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern.Stellen Sie sicher, dass Sie während der ersten Stunde regelmäßig die Fokussierung überprüfen, da sich das Mediumsagar absetzt und dies eine Fokusdrift verursachen kann. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, übertragen Sie die aufgenommenen Bilder zur Speicherung. Zerlegen Sie den Objektträgerkomplex, indem Sie ihn über Nacht in 90 % Ethanol einweichen, oder behandeln Sie die Dichtungen mit TOLA, um sie wiederverwenden zu können.Dieser Zeitrafferfilm zeigt em, die dem hier beschriebenen Nachweistest unterzogen wurden. Die Aufnahmerate beträgt ein Bild pro Minute bei einer Vergrößerung von 20x; die Wiedergabegeschwindigkeit beträgt 60 Bilder pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt eine Population von eant-Zellen, wobei 1 % der Zellen GFP exprimieren.Der Film wurde durch die Zusammenführung abwechselnder Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder erstellt. Der Assay wurde an C-T-T-Y-E in 1 % Aros mit einer Aufnahmerate von einem Bild pro Minute bei einer Vergrößerung von 100 x durchgeführt. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die Gleitmotilität von M Anthes.Dieser Test wurde an C-T-T-Y-E in 1 % Aros durchgeführt, wobei die Aufnahmerate ein Bild pro Minute bei einer Vergrößerung von 100 x beträgt. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die P OSA-Zuckungsbeweglichkeit. Dieser Test wurde auf LB in 1 % Aros durchgeführt, wobei die Aufnahmerate ein Bild pro Minute beträgt.Bei einer Vergrößerung von 20× beträgt die Wiedergabegeschwindigkeit 60 Bilder pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt, dass Smar Schwarmbeweglichkeit aufweist. Der Assay wurde auf LB und 1 % Agar durchgeführt, wobei die Aufnahmerate ein Bild pro Minute betrug.Bei einer Vergrößerung von 20× beträgt die Wiedergabegeschwindigkeit 60 Bilder pro Sekunde. Dieses Zeitraffervideo zeigt die Gleitmotilität von EGT. Dieser Test wurde auf LB mit 0,5 % Tag durchgeführt. Die Aufzeichnungsrate beträgt ein Bild pro Minute, bei einer Vergrößerung von 20× und einer Wiedergabegeschwindigkeit von 120 Bildern pro Sekunde aufgrund der Empfindlichkeit von 0,5 % arose in lv.Dieser Test verwendet die größeren Dichtungen, die in Abbildung eins B zu sehen sind. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Zeitrafferaufnahmen von bakteriellen Biofilmen erstellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und so präzise wie möglich vorzugehen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.

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