Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen kostengünstigen Zeitraffer-Mikrokinematographie-Assay mit ausreichender Genauigkeit zu entwickeln, um reproduzierbare und quantifizierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies wird durch die Verwendung von kostengünstigen, wiederverwendbaren Silikondichtungen für die Konstruktion von Agros-Media-Platten oder Objektträgern erreicht. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass diese Plattenkomplexe über eine Vielzahl von Medientypen und Agarkonzentrationen mehr als eine Woche lang hydratisiert und ausreichend sauerstoffhaltig bleiben.

Da die Mikrokinematografie im Zeitraffer ein langsamer Prozess ist, hilft der Einsatz von acht kostengünstigen Mikroskopen, die Datenerfassung zu beschleunigen. Hallo, ich bin Ryan Taylor aus dem Labor von Dr. Roy Welch vom Department of Biology der Syracuse University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erstellung von Zeitrafferfilmen von bakteriellen Biofilmen in unserem Labor, wir werden dieses Verfahren verwenden, um das multizelluläre Verhalten von MTI-Biofilmen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, messen Sie die Zelldichte einer Occus sanus-Kultur mit einem Clut-Messgerät, überführen Sie einen Milliliter der Kultur in ein 2,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, waschen Sie das Pellet und resuspendieren Sie die Bakterien in TPM-Medien, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben, pipetieren Sie und wirbeln Sie es ein, um das Pellet vollständig zu resuspendieren, was eine Weile dauern kann. Fügen Sie als Nächstes 0,5 Gramm Aros zu 50 Millilitern TPM hinzu, dem Assay-Medium.

Fügen Sie außerdem 0,5 Gramm Aros zu 50 Millilitern C-T-T-Y-E hinzu, dem zu sterilisierenden Disc-Medienautoklav. Halten Sie das Medium dann bei 55 Grad Celsius in einem Inkubator oder Wasserbad. Bei der Erstellung des Tracking-Assays.

Plattenkomplexe fahren fort, um das erste Flammensterilisator-Glasmikroskop der nutritiven Scheibe zu konstruieren. Schieben Sie und legen Sie eine sterile, 0,5 Millimeter dicke Silikonkautschukdichtung auf den Objektträger. Pipettieren rund 300 Mikroliter C TT YE Medien in die Vertiefung, die durch die Dichtung auf dem Objektträger entsteht.

Das C-T-T-Y-E Medium agro soll Flammen aufwirbeln, einen anderen Objektträger sterilisieren und schräg auf dem C-T-T-Y-E Medium absetzen. Das Abstellen der Rutsche in einem Winkel verhindert die Blasenbildung. Sobald die Rutsche an Ort und Stelle ist, polstern Sie den Komplex mit Mini-Bindeklammern auf, eine auf jeder Seite.

Den abgeschnittenen Komplex bei vier Grad Celsius platzieren und den C-T-T-Y-E media agro aushärten lassen. Dies dauert in der Regel etwa fünf Minuten. Sobald der Agro ausgehärtet ist, kann man die Plattenkomplexe vorbereiten, die im Tracking-Assay verwendet werden.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Objektträger für die Konstruktion der Assay-Komplexe. Für jede komplexe Flamme werden zwei Glasmikroskop-Objektträger sterilisiert. Legen Sie eine Autoklavendichtung auf einen der Objektträger, um den Boden des Assays zu bilden.

Die andere Rutsche wird zum Abflachen der Agros und als Stützrutsche verwendet. Die Oberseite des Assays befindet sich auf einem Deckglas. Wickeln Sie zuerst einen Objektträger mit Beschriftungsband ein, dann flammen Sie den Abdeckschirm aus Sterilisatorglas und legen Sie ihn sterilisiert auf den eingewickelten Objektträger.

Schieben Sie die umwickelte Rutsche nach oben, stützt Sie den Deckschirm und verhindert so ein Reißen. Legen Sie eine Autoklavendichtung mit einer Pinzette auf den flammsterilisierten Deckglas. Drücken Sie auf die Dichtungen am unteren Schieber und am Deckglas, um sicherzustellen, dass sie eine Dichtung mit dem Glas bilden.

Andernfalls kann es zu Austrocknung der Medien und Arrays kommen. Legen Sie die Gleitdichtung und die Deckglasdichtungen mit den sterilisierten Seiten nach oben beiseite, um zu verhindern, dass sich die Mediendichtung verfestigt, was zu einer schlechten Filmqualität führen würde. Beginnen Sie mit dem Platzieren der Nährstoffscheibe.

Entfernen Sie den Nährstoffscheiben-Komplex von vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Bind-Finsternis und den vorherigen Teil der Objektträger, wodurch das nun erstarrte C-T-T-Y-E aros freigelegt wird, mit einer Mikroprobenahmepipette mit einer 100-Mikroliter-Einwegspitze aus Glas. Nehmen Sie eine Nährscheibe mit einem Durchmesser von einem Millimeter ebenfalls aus dem C-T-T-Y-E media agro und legen Sie sie in die Vertiefung, die durch die Dichtung auf dem Deckglas entsteht.

Nehmen Sie dann das TPM-Medium agros aus dem Inkubator und pipettieren Sie 300 Mikroliter in die Vertiefung, die durch die Dichtung auf dem Deckglas entsteht und die Nährstoffscheibe enthält. Das TPM-Medium Agros sollte sich aufschütten, um das T-P-M-S-A-Medium zu glätten. Platzieren Sie einen der flammsterilisierten Objektträger ohne Dichtung in einem Winkel auf dem TPM-Medienbogen. Wenn Sie die Rutsche in einem Winkel platzieren, können Sie die Bildung von Blasen verhindern.

Klemmen Sie den Komplex mit Mini-Binderklammern zusammen, eine auf jeder Seite. Platzieren Sie den abgeschnittenen Komplex bei vier Grad Celsius und lassen Sie das entstandene Medium aushärten. Dies dauert in der Regel etwa fünf Minuten.

Sobald das Medium ausgehärtet ist, entfernen Sie den Komplex von vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Bindeklammern und drücken Sie das Ende des Komplexes zusammen. Um die mit Klebeband umwickelte Folie zu lösen, entfernen Sie die mit Klebeband umwickelte Folie und legen Sie sie zur weiteren Verwendung auf die Bank.

Dann mit einer Pinzette als Keil. Trennen Sie die Deckglasdichtung Media Agros Complex von der Stützschiene und entsorgen Sie die Stützschiene. Verwenden Sie keine Hebelbewegung, um den Dichtungskomplex des Deckglases zu trennen, da dies dazu führen kann, dass der Deckrost bremst und/oder das Medium am Stützschlitten kleben bleibt.

Legen Sie nach dem Entfernen des Stützschiebers den Deckschieber mit der Dichtungsseite nach oben auf den mit Klebeband umwickelten Schieber. Stellen Sie diesen Komplex neben einen Brenner, damit die gesamte sichtbare Feuchtigkeit von der neu freigelegten media agros-Oberfläche verdunsten kann. Lassen Sie das Medium nicht länger als eine Minute trocknen.

Da dies das Schwarmverhalten von M Zant beeinträchtigen könnte, fahren Sie mit der Platte der Zellen auf dem neu vorbereiteten Assay-Komplex fort. Sobald die überschüssige Feuchtigkeit aus dem Deckglasdichtungsmedium verdunstet ist, saugt der Agros-Komplex 0,5 Mikroliter der konzentrierten Zellen für die Abscheidung auf dem Medium an. Aeros drücken die Pipettenspitze, bevor sie sich dem Medium Agros nähern.

Ein Tropfen Zellen befindet sich an der Unterseite der Pipettenspitze, was die Ablagerung der Zellen erleichtert, ohne dass die Spitze das Medium agros berührt. Eine Vertiefung auf der Agros-Oberfläche kann das Verhalten des mz, des Schwarms, verändern. Bewegen Sie die Pipette gerade nach unten, um die Zellen etwa einen Millimeter von der eingebetteten Nährscheibe entfernt zu dosieren.

Ziehen Sie dann die Pipette gerade wieder nach oben. Auf diese Weise stellt man sicher, dass der Schwarm kreisförmig ist. Sobald die Zellen abgelagert sind, platzieren Sie den Komplex neben dem Brenner, damit die Zellen nicht länger als 20 Sekunden trocknen können.

Richten Sie nach dem Trocknen die Gleitdichtungsbaugruppe, die den Boden des Komplexes bildet, mit der Dichtung auf dem Deckel aus. Gleitdichtungsmedium Acro Zellkomplex, das die Oberseite des Komplexes bildet. Vorsichtig zusammendrücken, um eine Versiegelung zu bilden.

Reinigen Sie die Oberflächen des Objektträgers im Deckglas mit einem Kim-Tuch, um Rückstände zu entfernen und Kondensation zu vermeiden. Stellen Sie den Komplex unmittelbar nach der Reinigung der Objektträger mit dem Objektträger nach unten und dem Deckglas nach oben auf den beheizten Mikroskoptisch. Wenn sich Kondenswasser gebildet hat, lassen Sie den Objektträgerkomplex einige Sekunden lang auf dem beheizten Tisch sitzen, bevor Sie die Bildaufnahmesoftware starten.

Um den Film vorzubereiten, wählen Sie das passende Objektiv, zwei x vier x oder 10 x am Mikroskop. Schalten Sie die Kamera und das Mikroskop ein und überprüfen Sie die Lichtstärke, um sicherzustellen, dass das Licht nicht zu intensiv ist. Starten Sie den Computer und öffnen Sie das Bildaufnahmeprogramm.

Klicken Sie auf das Live-Bild-Fenster und fokussieren Sie das Mikroskop. Das Bild sieht ähnlich aus wie das hier gezeigte. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern.

Achten Sie darauf, den Fokus in der ersten Stunde regelmäßig zu überprüfen, da der Medienagar dazu neigt, sich abzusetzen, wodurch der Fokus abdriftet. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, übertragen Sie die erfassten Bilder zur Speicherung. Brechen Sie den Rutschenkomplex auf, indem Sie die Dichtungen über Nacht in 90%igem Ethanol einweichen oder TOLA für die Wiederverwendung verwenden.

Dieser Zeitrafferfilm zeigt em, wie er dem hier beschriebenen Tracking-Assay unterzogen wird. Die Aufnahmerate beträgt ein Bild pro Minute bei einer 20-fachen Vergrößerung, die Wiedergaberate beträgt 60 Bilder pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt eine Population von Zellen, bei denen 1% der Zellen GFP exprimieren.

Der Film wurde durch die Verschmelzung von alternierenden Phasenkontrast- und Fluoreszenzbildern zusammengestellt. Der Assay wurde auf C-T-T-Y-E mit einer Erfassungsrate von 1 % durchgeführt. Die Erfassungsrate beträgt ein Bild pro Minute bei einer 100-fachen Vergrößerung. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die gleitende Motilität von M Anthes.

Dieser Assay wurde an C-T-T-Y-E bei 1 %Aros Erfassungsrate von einem Bild pro Minute bei einer 100-fachen Vergrößerung durchgeführt. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die zuckende Motilität von P OSA. Dieser Assay wurde an LB bei 1 %Aros Erfassungsrate von einem Bild pro Minute durchgeführt.

Bei einer 20-fachen Vergrößerung liegt die Wiedergaberate bei 60 Bildern pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt Smar, wie er die wimmelnde Motilität spürt. Dieser Assay wurde mit LB durchgeführt und die Erfassungsrate von 1 % Aris beträgt ein Bild pro Minute.

Bei einer 20-fachen Vergrößerung liegt die Wiedergaberate bei 60 Bildern pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die gleitende Beweglichkeit von EGT. Dieser Assay wurde an LB bei 0,5 % durchgeführt. Die Tag-Rose-Erfassungsrate beträgt ein Bild pro Minute, da eine Vergrößerung von 20 x die Wiedergaberate 120 Bilder pro Sekunde beträgt, da die Fragilität von 0,5 % in LV auftrat.

Bei diesem Assay werden die größeren Dichtungen verwendet, die in Abbildung 1 B zu sehen sind. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Zeitrafferfilme von bakteriellen Biofilmen erstellen können. Wenn Sie dieses Verfahren ausführen. Es ist wichtig, sich Zeit zu nehmen und so präzise wie möglich zu sein, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.