Name: Methode zur Isolierung von Francisella tularensis Äußeren Membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Lernen Sie die Isolierung äußerer Membranvesikel von Francisella tularensis durch osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Membranproteinen für Impfstoffforschung.

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Das beschriebene Projekt wurde von Grant Numbers P01 AI055637 und U54 AI057156 von NIAID / NIH unterstützt. Sein Inhalt sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des RCE Programme Office, NIAID oder NIH.

Tag 1: F. tularensis Platte Impfung <ol><li> Platte eingefroren Stammkulturen von F. tularensis auf Mueller-Hinton-Agar mit 2,5% (vol / vol) Donor Kälberserum, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol) Glucose und 0,025% (wt / vol) Eisenpyrophosphat ergänzt. Wachsen F. tularensis bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ca. 24 h. </li></ol> Tag 2: F. tularensis flüssigen Medien Impfung <ol><li> Vorbereiten und Autoklaven 1 Liter Kationen-eingestellt Mueller-Hinton-Medium (mit 1,23 mm Calciumchloriddihydrat und 1,03 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat). Nach dem Abkühlen auf 37 ° C, weiter ergänzen Medium mit 0,1% (wt / vol) Glukose, 0,025% (wt / vol) Eisenpyrophosphat, und 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filter sterilisieren (0,22 μ)-Medium in zwei 500-ml-Portionen. </li><li> Nehmen Sie 12 ml ergänzt Mueller-Hinton-Medium und Überführung in eine sterile 50-ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Mit einer sterilen 10-ul Impföse, kratzen eine große Öse F. tularensis Wachstum von Agarplatten (ab Tag 1) und übertragen die Bakterien in 12 ml Mueller-Hinton-Medium (siehe Schritt 2). Pipettenlösung mehrfach den Break-up Klumpen und bereiten homogene Bakteriensuspension. Nicht vortexen. </li><li> Mit einer sterilen Pipette impfen jedes 500-ml-Gefäß mit 5 ml Bakteriensuspension aus Schritt 3. Wachsen Brühe Kulturen bei 37 ° C für 14 bis 18 h unter leichtem Schütteln (190-200 rpm auf einem New Brunswick Innova 2300 Serie Schüttler). </li></ol> Tag 3: Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Erhalten F. tularensis Kulturen aus dem Schüttelinkubator und entfernen Sie eine 1-ml-Aliquot aus jedem 500-ml-Kultur in den jeweiligen optischen Dichten zu überprüfen. Wir haben eine optimale Membran-Extraktion und Isolierung Ergebnisse bei der Verwendung von F. tularensis Zellen in der frühen logarithmischen Phase des Wachstums, die mit einer OD 600 korreliert zwischen 0,2 bis 0,4 (~ 10 Juli - 10 August CFU / ml). Kulturen mit einer OD 600 von weniger als 0,2 wird nicht nachgeben ausreichende Menge von insgesamt Membranmaterial für nachfolgende Saccharosegradienten. Umgekehrt haben Kulturen mit einer OD 600 von mehr als 0,4 (kurz vor der stationären Phase) wurde festgestellt, mixed-Membran-Fusionen ergeben. </li><li> Centrifuge Kulturen bei 7.500 x g für 30 min bei 15 ° C zu sammeln der Zellen. Wir empfehlen Zentrifugation der Kulturen in vier 250-ml Zentrifugenbecher, weil es nachfolgenden Pellets Aufhängung erleichtert. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Medien Überstand aus jeder Zentrifugenflasche und fest tippen Sie auf die Flaschen auf saugfähigen Material, um überschüssige Wachstumsmedium zu entfernen. </li><li> Innerhalb von 10 min nach Beendigung der Zentrifugation auszusetzen jeder Bakterienpellet in 8,75 ml von 0,75 M Saccharose (in 5 mM Tris, pH 7,5). Alle vier Bakterienpellets ausgesetzt und übertragen werden (35 ml insgesamt Bakteriensuspension) in eine sterile 250-ml-Flasche (mit einem kleinen Rührerstab) innerhalb von 10 min. </li><li> Während sanft Mischen der Zellsuspension auf einer stirplate, langsam 70 ml (2 Bände) von 10 mM EDTA (in 5 mM Tris, pH 7,8) im Laufe von 10 min. Fügen Sie die EDTA-Lösung mit der Spitze der Pipette unter der Zellsuspension Ebene zu erhöhten lokalen Konzentrationen von EDTA zu vermeiden. Die Rührerstab sollte mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zu durchmischen die Zellsuspension, aber nicht schnell genug, um zu Schaumbildung führen oder Blasenbildung sein dreht. Nach der EDTA-Lösung hinzugefügt wurde, inkubieren Sie die Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der 30 min Inkubation langsam zugeben 11 ml (1 / 10 th Volumen) einer 2 mg / ml Lysozym-Lösung auf eine Endkonzentration von 200 ug / ml. Fahren Sie mit der Zellsuspension während der Lysozym-Lösung zusätzlich zu mischen. Wie oben erwähnt, fügen Sie den Lysozym-Lösung mit der Pipettenspitze unterhalb der Zellsuspension Flüssigkeitsstand zu erhöhten lokalen Konzentrationen von Lysozym zu vermeiden. Lager Lysozym-Lösungen (2 mg / ml) kann in Einzel-Portionen zubereitet werden und bei -20 ° C für drei Minuten vor vier Monaten. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Während der 30 min Inkubation Vorbereitung eines sterilen 1L Flasche mit einem kleinen Rührerstab und 530 ml Raumtemperatur CellGro Molecular Grade dH 2 O (4,5 Volumen). </li><li> Osmotisch lysiert die Zellsuspension (aus Schritt 6) durch langsame Verdünnung (Flussrate von ca. 11 ml / min) in 530 ml für Molekulare Grade dH 2 O (aus Schritt 7) im Laufe der 10 bis 15 min unter leichtem Mischen. Wegen der größeren Volumen der Lösung in diesem Schritt erhöhen Rührerstab Geschwindigkeit, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten. Die Rührerstab sollte mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um gründlich zu dispergieren die Zellsuspension einmal, um die dH 2 O hinzugefügt werden rotierende aber nicht schnell genug, um Schaumbildung oder Blasenbildung führen. Fügen Sie die Zellsuspension mit der Spitze der Pipette ruht auf dem Boden des Kolbens, angrenzend an die Rührerstab, um eine gleichmäßige Verdünnung der cel erleichternl Suspension. Wir haben festgestellt, dass 25-ml-Pipetten beste Arbeit in diesem Schritt. Sorgfältig überwachen die Verdünnung Prozess und unterbrechen den Durchfluss wie nötig, um lokale Ansammlungen von Zellen, Zellklumpen, und die Zelle Strähnen verteilen. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass dieser Schritt zu einer der anspruchsvollsten und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments zu sein scheint. </li><li> Nach der 30 min Inkubation Transfer 40 ml Aliquots der osmotische Lyse-Lösung in 50-ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 7500 xg für 30 min bei 10 ° C an intakte Zellen und Ablagerungen zu entfernen. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig von 27 bis 30 ml Überstand aus jeder konischen Rohr und Pool Überstände in einem sterilen 1L Flasche </li><li> Transfer 25 ml gepoolt Überstand, die jeweils in 16 Ultrazentrifuge-und Zentrifugenröhrchen bei 200.000 x g (44.400 rpm in F50L-8x39 Fiberlite Ultrazentrifuge Rotor) für 2 h bei 4 ° C. Beachten Sie, dass jeder Rotor 8 Röhrchen hält, so dass dieser Schritt erfordert zwei Rotoren und zwei Ultrazentrifugen. Alternativ sollte der zweite Satz von 8 Röhrchen bei 4 ° C aufbewahrt werden, bis zentrifugiert. </li><li> Innerhalb von 10 min nach Beendigung der Ultrazentrifuge laufen, bereiten Membran Resuspensionspuffer geändert. Transfer-8 ml Membransuspension Puffer (25% [w / w] Saccharose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2), um ein steriles Röhrchen geben und 1 Tablette EDTA-freie Protease Inhibitor Cocktail und 375 U Benzonase. Vorsichtig mischen Lösung Protease-Inhibitor Tablette auflösen. </li><li> Nach Ultrazentrifugation, sorgfältig abgießen Überstände, Invertzucker Ultrazentrifuge Rohre auf saugfähigen Material, und fest Leitungswasser Röhren, um überschüssige Überstand zu entfernen. Markieren Sie die Position der einzelnen Membran-Pellet mit einem Marker, um die Visualisierung zu helfen. Vorsichtig resuspendieren acht Membran-Pellets mit 600 ul jeweils modifizierte Membran Resuspensionspuffer. Übertragen Sie jede Membran Resuspension auf den nächsten Satz von acht Röhren vorsichtig resuspendieren diese acht Pellets, und der Pool der resultierenden Membran resuspensions in einem sterilen Röhrchen. Die pelletierten Membranen sind schwer zu suspendieren, so auch weiterhin das Bestehen der modifizierten Membran Resuspensionspuffer über das Pellet bis es weg von der Wand des Rohres schält. Es ist oft notwendig, die Mikropipette Spitze verwenden, um die Membran Pellet aus der Rohrwand und Hilfe kratzen in der Resuspension Prozess. Beim Pipettieren vermeiden Aufschäumen oder Blasenbildung. Beachten Sie, dass dieser Schritt zu einer der anspruchsvollsten und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments zu sein scheint. </li><li> Wenn die Membran-Pellets wurden resuspendiert und aus allen 16 Röhren, waschen alle vier Röhren mit 600 ul der modifizierten Membran Resuspensionspuffer. Die Wäsche sollte um den markierten Bereich (Membran Pellet) jeder Röhre fokussiert werden. Übertragen Sie die Wäsche in die Membran Resuspension Röhre. Wiederholen Sie den Waschvorgang für die restlichen drei Sätze von vier Röhren. </li><li> Inkubieren Sie die Membran Resuspension unter leichtem Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur zu DNA und Hilfe bei der Reduktion von flockiges Material zersetzen. </li><li> Nehmen Sie eine kleine Teilmenge der Membransuspension und führen Protein Quantifizierung auf insgesamt Membran Ertrag. Wir bereiten in der Regel unverdünnt, verdünnt 1:1 (in 2,5% SDS), und 1:3 verdünnt (in 2,5% SDS)-Membran-Proben, Wärme die Proben bei 90 ° C für 10 min, und die Verwendung des BioRad DC Protein Assay zur Quantifizierung die Membran Resuspension Proteinkonzentration. Insgesamt Proteinausbeute ist in der Regel zwischen 1,0 mg / ml und 1,6 mg / ml. Die Nutzung von Wärme und SDS sind erforderlich, um OMPs aus dem extrahierten Membranen, so dass eine genauere Quantifizierung Protein-Wert erhalten werden kann loslassen. </li><li> Bereiten linear Saccharosegradienten durch Schichtung 1,8 ml jeder der Saccharose-Lösungen (wt / wt, bereitete in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear Ultrazentrifuge Rohre in der folgenden Reihenfolge: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Layering von Saccharosegradienten ist am einfachsten zu führen, wenn Sie eine Glühbirne Pipette und nicht ein automatisiertes Pipette. </li><li> Basierend auf der Membran Resuspension Protein Quantifizierung (Schritt 16), Layer 1,5 mg Membran Resuspension übereinander Gradienten. Jede 14 x 95 mm Ultrazentrifuge Rohr hat eine maximale Kapazität von 12,5 ml und, da die 10,8 ml für durch die Saccharose-Lösungen von Step 17 zu bilanzieren, sollten Sie nicht mehr als 1,7 ml Membran Resuspension pro Gradienten. Individuell abwägen und sorgfältig einstellen das Endgewicht der einzelnen Sucrosegradienten Rohr (durch Hinzufügen oder Entfernen Membran Resuspension), so dass alle Rohre gleich (± 0,01 g) wiegen. </li><li> Transfer Saccharosegradienten in eine SW-40Ti Ausschwingrotor und Zentrifuge bei 256.000 x g (38.000 rpm) für mindestens 17 h bei 4 ° C. </li></ol> Tag 4: Sammlung von Saccharose-Gradienten-Fraktionen <ol><li> Nach 17 h Zentrifugation, stoppen Sie die Zentrifuge laufen, und entfernen Sie vorsichtig Saccharosegradienten aus dem SW-40Ti Rotor. </li><li> Reinigen Sie die Unterseite des Saccharose-Gradienten Rohr mit 70% Ethanol, Punktion derBoden des Röhrchens mit einer 21g Nadel, und sammeln Sie sequenzielle 500 ul-Fraktionen aus dem Gradienten in sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Gradienten. Die Steigung erlaubt sein sollte, durch die Schwerkraft fließen Tropf sein, um nicht zu stören, die Saccharose-Gradienten. Wenn jedoch das tropfenden hört aus dem Boden des Gradienten Rohr, kann eine kleine Menge von Druck auf das obere Ende des Rohres mit dem Finger aufgetragen werden. </li><li> Bestimmen Sie den Brechungsindex jeder Sucrosegradienten Bruchteil mit einem Refraktometer und korrelieren den Brechungsindex mit einer spezifischen Dichte in g / ml 1. Beurteilen Proteinlokalisierung durch die Vorbereitung Vertreter Sucrosegradienten Fraktionen (Dichte Schritten von 0,01; von 1,11 g / ml bis 1,26 g / ml) für die SDS-PAGE-Trennung, Transfer auf Nitrozellulose und Immunoblot. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wenn korrekt durchgeführt, die Ergebnisse dieses Verfahrens in der vollständigen Trennung von IM und OM Vesikel aus beiden Typ A (zB SchuS4) und Typ B (zB LVS) Stämme von F. tularensis. Wie in repräsentativen Immunoblots in Abbildung 1, F. gezeigt tularensis OMPs lokalisieren zwischen Dichten von 1,17 und 1,20 g / ml. Im Vergleich zu lokalisieren IMPs zwischen Dichten von 1,13 und 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Immunoblotting von F. tularensis Saccharose-Dichtegradienten. Sequential Fraktionen wurden aus Steigungen und Dichten (g / ml) wurden basierend auf Brechungsindizes berechnet gesammelt. Die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und immunogeblottet zu OMP und IMP Fraktionierung zu erkennen. mw, prestained Molekulargewichtsstandards mit Größen (in kDa) stellte fest, auf der linken Seite eines jeden Fleck. LVS, Ganzzelllysaten von F. tularensis LVS. Die entsprechenden Sucrosegradienten Bruchteil Dichten sind über ihre jeweiligen Fahrspuren zur Kenntnis genommen. OMPs und IMPs, wie in den linken Rand vermerkt, wurden mit polyklonalen, monospezifischen Antiseren erkannt. Ähnliche Ergebnisse wurden für F. erhalten tularensis SchuS4.

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</ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine Variation des Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation &quot;Goldstandard&quot; für die physikalische Trennung und Anreicherung von Gram-negativen Bakterien OMs aus anderen zellulären Komponenten 2, 3, 4. Während wir zuvor beschrieben die Anwendung dieser Methode zur Isolierung von OMs aus beiden Typ A und Typ B-Stämme von F. tularensis 5, bietet diese Präsentation einen detaillierteren und optimierte Verfahren für OM Isolation. Tatsächlich ist dies ein wichtiger Fortschritt für die Identifizierung potenziell an der Oberfläche ausgesetzt und mutmaßlichen Virulenzfaktoren von dieser tödlichen Erreger. Die Bedeutung dieser Verfahren wurde in Studien, die von unserem Labor zeigen, dass die Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem OMPs gewährt wesentlichen Schutz gegen virulenten Typ A F. nachgewiesen tularensis pulmonalen Herausforderung 6. Wie oben erwähnt, Wachstumsphase der Bakterienzellen, die sorgfältige Überwachung während osmotischen Lyse und schonende Resuspension von Membran-Pellets sind wichtige Schritte, die mit Erfolg / Misserfolg dieser Membrantrennverfahren Verfahren korrelieren scheint. Während diese optimierte Methode ist streng und unterliegt einigen experimentellen Variabilität scheinen die daraus resultierenden OMs auf der bemerkenswert verbesserten Reinheit sein, dass diejenigen sammelte aus der Verwendung von Waschmitteln, Lithiumchlorid, oder Natriumcarbonat 7, 8, 9, 10, 11 verglichen, 12.

<table><tbody><tr><td>Serum von Spenderkälbern</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro Molekulargrad dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>38,5-ml-Polycarbonatflasche</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>F50L-8x39-Ultrazentrifugenrotor</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini EDTA-freie Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>DC-Protein-Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14x95-mm-Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>SW-40Ti-Schwingkorbrotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Abbe-Bankrefraktometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

methode zur isolierung von francisella tularensis Äußeren membranen

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis ist ein Gram-negative intrazelluläre Coccobacillus und der Erreger der Zoonose Tularämie. Wenn mit anderen bakteriellen Erregern, die extrem niedrige infektiöse Dosis (&lt;10 CFU), schnelle Progression der Erkrankung und eine hohe Morbidität und Mortalität nahe, dass die Stämme von Francisella für neue Virulenzfaktoren kodieren verglichen. Oberflächen-exponierten Moleküle, nämlich Proteine ​​der äußeren Membran (OMPs), haben gezeigt, dass bakterielle Wirtszelle binden, eingang, intrazelluläre Überleben, Virulenz und Immunevasion fördern. Die Relevanz für das Studium OMPs wird durch die Tatsache, dass sie als schützende Impfstoffe gegen eine Reihe von bakteriellen Krankheiten dienen unterstrichen. Während OMPs aus gram-negative Bakterien durch Bulk-Membran-Extraktion Techniken, einschließlich Beschallung von Zellen durch Zentrifugation und / oder Detergensextraktion gefolgt extrahiert werden, sind diese Präparate oft mit periplasmatischen und / oder zytoplasmatische (innen)-Membran (IM) Verunreinigungen kontaminiert. Seit Jahren der &quot;Goldstandard&quot;-Methode für die biochemische und biophysikalische Trennung von gram-negative IM und äußeren Membranen (OM) hat vorbehaltlich Bakterien Spheroplasting und osmotische Lyse, gefolgt von Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Einmal auf einer Saccharose-Gradienten können OMs von IMs auf der Grundlage der Unterschiede in der lebhaften Dichten getrennt werden, die vermutlich größtenteils auf das Vorhandensein von Lipopolysaccharid (LPS) in der OM ausgesagt werden. Hier beschreiben wir eine strenge und optimierte Methode zu extrahieren, zu bereichern und zu isolieren F. tularensis äußeren Membranen und die damit verbundenen OMPs.

Ein Protokoll für die Trennung von innerer und äußerer Membranen aus<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Durch Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation.

Methode zur Isolierung von Francisella tularensis Äußeren Membranen

Francisella tularensis ist ein gramnegativer intrazellulärer Kokkobazillus und der Erreger der zoonotischen Erkrankung Tularämie. Im Vergleich zu anderen ...

Die Isolierung von äußeren Membranvesikeln von Francisella und der assoziierten äußeren Membranproteine beginnt mit der osmotischen Lyse bakterieller Zellen. Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase werden nacheinander mit hypertonischer Saccharoselösung, EDTA und Lysozym behandelt, bevor sie langsam in entionisiertes Wasser verdünnt werden. Die resultierenden bakteriellen Lysate werden einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit unterzogen, um zellulären Bruch und unlysierte Zellen zu entfernen, gefolgt von einer Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit zur Pelletierung der Membranvesikel.Anschließend werden gesamte Membranvesikel auf Saccharosedichtegradienten aufgetragen, um Innere-Membran- oder IM-Vesikel von Äußere-Membran- oder OM-Vesikeln zu trennen. OM-Vesikel können von IM-Vesikeln basierend auf Unterschieden in ihrer Schwimmdichte getrennt werden, die vermutlich hauptsächlich auf der Anwesenheit von Lipopolysaccharid oder LPS in der äußeren Membran beruhen. Immunschichtanalysen aufeinanderfolgender Fraktionen aus Saccharosedichtegradienten zeigen eine räumliche Trennung von Proteinen der inneren Membran von Proteinen der äußeren Membran. Hallo, ich bin Dr. Michael Norgaard, und dies ist Dr. Jason Huntley aus der Abteilung für Mikrobiologie am UT Southwestern Medical Center in Dallas.Heute wird Ihnen Dr. Huntley ein Verfahren zur Extraktion, Anreicherung und Isolierung der äußeren Membranen von Francisella-Zellen sowie der assoziierten Membranproteine vorstellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Moleküle zu untersuchen, die in der äußeren Membran lokalisiert sind und möglicherweise an der Oberfläche dieses intrazellulären bakteriellen Pathogens exprimiert werden. Da wir einen vollen Tag vor uns haben, sollten wir nun beginnen.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zwei 500 Milliliter Kulturen von FCIs-Bakterien vor und kultivieren Sie sie gemäß des begleitenden schriftlichen Protokolls. Entnehmen Sie die bakteriellen Kulturen aus dem Schüttelinkubator und entnehmen Sie aus jeder Kultur ein Milliliter Eloqua zur OD-Messung, um Zellen in der frühen logarithmischen Wachstumsphase zu erhalten, was einer OD 600 zwischen 0,2 und 0,4 entspricht. Für optimale Ergebnisse bei der Membranextraktion und -isolation sollten die Kulturen die gewünschte OD 600 erreichen.Verwenden Sie vier 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um die Kulturen bei 7.500 × g für 30 Minuten bei 15 °C zu zentrifugieren, um die Zellen zu gewinnen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus jedem Zentrifugenröhrchen und klopfen Sie die Röhrchen fest auf saugfähiges Material, um überschüssiges Wachstumsmedium zu entfernen. Innerhalb von 10 Minuten nach Beendigung der Zentrifugation suspendieren Sie jedes bakterielle Pellet in 8,75 Milliliter 0,75-molarer Saccharose in 5-millimolarer Tris-Pufferlösung (pH 7,5).Nach der Suspension jedes Pellets die Lösung in einen sterilen 250-Milliliter-Kolben überführen, wobei ein kleiner Rührstab verwendet wird. Dies für alle vier Bakterienpellets wiederholen, wobei die endgültige Suspension der Bakterienpellets insgesamt 35 Milliliter beträgt. Die Zellsuspension gründlich auf einer Rührplatte mischen, jedoch nicht zu schnell.Um Schäumen oder Blasenbildung beim langsamen Mischen zu vermeiden, geben Sie über einen Zeitraum von 10 Minuten 70 Milliliter einer 10-Millimolar-EDTA-Lösung zur Suspension hinzu. Halten Sie die Pipettenspitze dabei unterhalb des Niveaus der Zellsuspension, um lokal erhöhte EDTA-Konzentrationen zu vermeiden. Nach Zugabe des EDTA inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur.Dann, während weiterhin langsam gerührt wird, 11 Milliliter einer zwei Milligramm pro Milliliter Lysozym-Lösung zur Endkonzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Die Zellsuspension während der Zugabe der Lysozym-Lösung weiterhin mischen. Wie zuvor die Pipettenspitze unterhalb des Niveaus der Zellsuspension halten.Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Lysozym. Bereiten Sie während dieser Inkubation einen sterilen Ein-Liter-Kolben mit einem kleinen Rührstab und 530 Milliliter Wasser von molekularbiologischer Qualität, das entionisiert und auf Raumtemperatur gebracht wurde, vor.Wenn die Zellen die Inkubation abgeschlossen haben, lysieren Sie die Zellsuspension osmotisch unter Verwendung einer 25-Milliliter-Pipette, die auf dem Boden des Kolbens neben dem Rührstab aufliegt, und verdünnen die Zellen langsam über einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten unter sanftem Rühren in das Wasser im Ein-Liter-Kolben. Dieser Schritt ist anspruchsvoll und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments. Das Rühren sollte schnell genug sein, um die Zellsuspension vollständig zu verteilen, jedoch nicht so schnell, dass Schaumbildung oder Blasen entstehen, soweit erforderlich.Erhöhen Sie langsam die Drehzahl des Rührstabs, um eine ordnungsgemäße Durchmischung sicherzustellen. Überwachen Sie sorgfältig den Verdünnungsprozess und passen Sie die Fließgeschwindigkeit an oder drehen Sie das Kolben gegebenenfalls, um lokale Ansammlungen von Zellen, Zellklumpen und Zellfasern zu verteilen. Sobald alle Zellen zugegeben wurden, inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation überführen Sie 40-Milliliter-Aliquote der osmotischen Lyse-Lösung in 50-Milliliter-Konischkolben und zentrifugieren 30 Minuten bei 7.500 × g und 10 °C.Um intakte Zellen und Zelltrümmer nach der Zentrifugation zu entfernen, vorsichtig 27 bis 30 Milliliter Überstand von jedem kegelförmigen Reagenzglas abnehmen und den Überstand in einem sterilen Ein-Liter-Kolben sammeln. 25 Milliliter des gesammelten Überstands in jeweils 16 Ultrazentrifugenröhrchen überführen und zwei Stunden bei 200.000 Gs und vier Grad Celsius zentrifugieren. Zehn Minuten vor Beendigung der Zentrifugation.Bereiten Sie den modifizierten Membranresuspendierpuffer vor. Kombinieren Sie acht Milliliter Membranresuspendierpuffer mit einer Tablette EDTA-freier Proteaseinhibitorcocktail und 375 Einheiten Benzonase in einem sterilen Gefäß und mischen Sie vorsichtig nach der Zentrifugation der lysierten Zellen. Fahren Sie fort, um das Membranpellet zu gewinnen.Wenn die Ultrazentrifugation der lysierten Zellen abgeschlossen ist, gießen Sie vorsichtig das Überstandsgemisch ab, drehen Sie die Röhrchen auf saugfähigem Material um und klopfen Sie sie fest an. Um überschüssiges Überstandsgemisch zu entfernen, kennzeichnen Sie die Position jedes Membranpellets mit einem Stift, um die Visualisierung zu erleichtern. Resuspendieren Sie vorsichtig acht Membranpellets mit jeweils 600 Mikrolitern modifiziertem Membranresuspendierpuffer.Es ist schwierig, die Membran-Pellets erneut in Suspension zu bringen. Fahren Sie daher vorsichtig damit fort, die modifizierte Membran-Resus-Aufschlämmungspufferlösung über das Pellet zu pipettieren, bis es sich von der Wand des Röhrchens löst. Dies ist ein weiterer Schritt, der herausfordernd und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments ist.Falls erforderlich, verwenden Sie die Mikropipettenspitze, um das Membranpellet von der Röhrenwand abzukratzen. Vermeiden Sie beim Pipettieren Schaumbildung oder Blasenbildung, da übermäßige Scherkräfte zur Bildung gemischter Myzelien führen, was eine Membrantrennung unmöglich macht. Überführen Sie jede Membranresuspendierung in den nächsten Satz von acht Röhrchen.Hängen Sie die verbleibenden Pellets vorsichtig in Suspension und vereinigen Sie alle Suspensionen in einem sterilen Reagenzglas. Nachdem Sie die Membran-Pellets aus allen 16 Röhrchen entfernt haben, waschen Sie jeweils vier Röhrchen mit 600 µL modifiziertem Membran-ReSuspensionspuffer. Konzentrieren Sie die Wäsche auf den markierten Bereich jedes Röhrchens und vereinigen Sie die Waschflüssigkeit mit den resuspendierten Membranen.Wiederholen Sie die Waschung für die verbleibenden Röhrchen. Inkubieren Sie die membranöse Re-Suspension unter leichtem Schütteln 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die DNA abzubauen und die Reduktion flockiger Bestandteile zu unterstützen. Entnehmen Sie anschließend eine kleine Menge der membranösen Suspension und führen Sie eine Proteinbestimmung durch.Um die Gesamtmembranausbeute zu bestimmen, bereiten Sie eine Verdünnung des Membransuspensions im Verhältnis 1:1 und 1:3 in 2,5 % SDS bei 90 °C für 10 Minuten zu. SDS und Hitze sind erforderlich, um O MPS aus den extrahierten Membranen freizusetzen. Verwenden Sie den BioRad DC Protein-Assay, um die Proteinkonzentration der Membranresuspension zu quantifizieren.Die Gesamtmenge an Protein liegt im Allgemeinen zwischen ein und 1,6 Milligramm pro Milliliter. Sobald die Proteinkonzentration in der Membranpräparation bestimmt wurde, können die Proben in einem Saccharosegradienten getrennt werden. Beginnen Sie damit, eine Reihe von Saccharoselösungen in EDTA herzustellen.Um die linearen Saccharosegradienten herzustellen, geben Sie mit einer Pipettierhilfe jeweils 1,8 Milliliter jeder Saccharoselösung in 14 × 95 Millimeter UltraClear-Ultrazentrifugenröhrchen in der folgenden Reihenfolge: 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % und 30 %. Danach pipettieren Sie 1,5 Milligramm Membranresuspendierungssuspension vorsichtig auf jeden Gradienten. Laden Sie nicht mehr als 1,7 Milliliter Membranresuspendierungssuspension pro Gradient auf. Wiegen Sie jedes Röhrchen einzeln und passen Sie das Endgewicht sorgfältig an, indem Sie Membranresuspendierungssuspension hinzufügen oder entfernen, sodass alle Röhrchen das gleiche Gewicht aufweisen. Überführen Sie die Saccharosegradienten in einen SW-40-TI-Schwingkorbrotor und zentrifugieren Sie bei 256.000 × g für mindestens 17 Stunden bei vier Grad Celsius.Nach 17 Stunden Zentrifugation beenden Sie den Zentrifugationslauf und nehmen Sie die Saccharose-Gradienten vorsichtig vom Rotor. Sammeln Sie anschließend die Fraktionen. Reinigen Sie den Boden des Saccharose-Gradientenrohrs vorsichtig mit 70 % Ethanol.Dann perforieren Sie den Boden des Röhrchens mit der 21-Gauge-Nadel und sammeln nacheinander 500-Mikroliter-Fraktionen aus der Gradienten in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen. Die Gradientenlösung sollte durch Schwerkraft tropfenweise abfließen, um die Saccharosegradienten nicht zu stören. Falls jedoch der Tropfenfluss aus dem unteren Ende des Gradientenröhrchens zum Erliegen kommt, kann durch leichtes Auflegen eines Fingers ein geringer Druck auf das obere Ende des Röhrchens ausgeübt werden.Bestimmen Sie abschließend den Brechungsindex jedes Saccharosegradientenbruchteils mithilfe eines Refraktometers und korrelieren Sie den Brechungsindex mit einer spezifischen Dichte in Gramm pro Milliliter. Bewerten Sie die Proteinlokalisation repräsentativer Saccharosegradientenbruchteile durch SDS-PAGE-Trennung und Immunschichtanalyse. Hier ist eine Immunschichtanalyse von Bruchteilen des Saccharosegradienten, der zur Trennung der Membranen verwendet wurde, die aus lysierten Freis-Lebendimpfstamm-Freis-Außenmembranproteinen oder Omps gewonnen wurden, die zwischen Dichten von 1,17 und 1,2 Gramm pro Milliliter lokalisiert sind.Im Vergleich dazu lokalisierten sich innere Membranproteine oder IPs zwischen Dichten von 1,13 und 1,14 Gramm pro Milliliter. Ähnliche Ergebnisse wurden für den FHU4-Stamm erhalten. Ich habe soeben demonstriert, wie man äußere Membranvesikel von Francisella durch osmotische Lyse und Ultrazentrifugation in einer Saccharosedichtegradienten isoliert und gewinnt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Bakterienzellen in der frühen logarithmischen Wachstumsphase zu verwenden, um sie während des osmotischen Glyko-Schritts langsam, aber kontinuierlich in entionisiertem Wasser zu verdünnen, sowie besondere Vorsicht beim Resuspendieren der Ultrazentrifugations-Membranpellets walten zu lassen. Damit ist unser Membrantrennverfahren abgeschlossen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren zukünftigen Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Trennung von inneren und äußeren Membranfraktionen von gramnegativen Bakterien

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Ultrazentrifugationsbasierte Isolierung von Legionella-pneumophila-Außenmembranvesikeln

Dieses Protokoll beschreibt intratrachealen Impfungen von Fischer 344 Ratten mit Francisella Tularensis. Dieses Verfahren ahmt pulmonale Exposition von Menschen gegenüber dieser potenziellen Biothreat Agent und kann zum Testen Impfstoff und therapeutische Wirksamkeit gegen pulmonale Tularämie verwendet werden.

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Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

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Methode zur Isolierung von Francisella tularensis Äußeren Membranen

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