Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, retrovirale Vektoren in das Vorderhirn der Maus zu bringen, bevor die Neurogenese in dieser Region beginnt. Diese Methode wird die Transduktion von Keimzonenzellen mit Genen von Interesse ermöglichen. Auch andere virale Vektoren oder Zellen könnten mit dieser Methode injiziert werden.

Dies wird erreicht, indem zunächst eine Laparotomie an einer narkotisierten schwangeren Maus durchgeführt wird, die den Zugang zu den Embryonen ermöglicht. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, die schwangere Maus auf dem Injektionstisch unter den Ultraschallwandler zu legen. Positionieren Sie dann die Embryonen für die Injektion auf der Platte.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mikroinjektionsnadel mithilfe des Echtzeit-Ultraschallbildes auf die Injektionszielstelle zu richten. Die Embryonen werden in Reihe injiziert, bis die gewünschte Anzahl erreicht ist. Der letzte Schritt des Eingriffs besteht darin, die Maus aus dem Injektionsgerät zu entfernen und die Schnitte in der Körperwand, den Muskeln und der Haut zu verschließen.

Das Tier darf sich dann erholen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Lokalisation und die phänotypischen Eigenschaften infizierter Zellen durch den Nachweis eines bestimmten Reportergens in Gewebeschnitten und die Markierung mit zelltypspezifischen Markern zeigen. Hallo, ich bin Taryn Pier Fois aus dem Labor von Nick Guyano im Neurogeneration-Programm an der Johns Hopkins University School of Medicine.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, bei dem ein Ultraschallbild verwendet wird, um die Mikroinjektion von retroviralen Vektoren in das Gehirn der Maus in utero am Embryonaltag 9,5 zu leiten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Auswirkungen der Manipulation der Genexpression während der Entwicklung von vier Gehirnen auf das Verhalten von Neurostamm- und Vorläuferzellen und die Sulfatspezifikation zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Wenn die Injektionen gentechnisch veränderte virale Vektoren enthalten sollen, sollte das Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Lege eine betäubte schwangere Maus auf den Rücken. Verwenden Sie eine feine chirurgische Schere, um einen 1,50 Zoll langen Längsschnitt durch die Haut an der Mittellinie zu machen.

Schneiden Sie das Bindegewebe ab, das sich zwischen der Haut und dem Muskel befindet, der den Schnitt umgibt. Machen Sie dann mit einer Zange einen etwas kürzeren Schnitt durch den Bauchmuskel. Ziehen Sie die Gebärmutterhörner vorsichtig heraus.

Notieren Sie die Anzahl der Embryonen auf jeder Seite. Bringen Sie das Tier in die Plexiglas-Injektionsstufe. Zum Schutz der Embryonen.

Setzen Sie die meisten Gebärmutterhörner wieder in das Tier ein, so dass nur zwei benachbarte Embryonen freiliegen. Verwenden Sie eine 10 Zentimeter große Petrischale mit zwei kleinen Reißzwecken und einem zwei Zentimeter großen Mittelloch, das mit einem Stück Scholastic Membran verschlossen ist, um die Embryonen feucht zu halten. Mit einer Pinzette, die leicht durch die Scholastmembran geschoben wurde.

Senke die Schüssel über die Mutter. Beim Absenken der Schüssel. Fassen Sie das Gebärmuttergewebe zwischen den beiden ausgewählten Embryonen und ziehen Sie es vorsichtig durch die Membran, wenn die Schale ausgesät wird.

Befestigen Sie es mit zwei Reißzwecken durch die kleineren Löcher und in das Wachs. Füllen Sie die Schale mit 37 Grad Celsius, einem XPBS, um die Embryonen feucht zu halten. Richten Sie die Embryonen parallel zur Länge der Mutter aus.

Legen Sie die Injektionsstufe unter die Ultraschallsonde. Senken Sie die Sonde auf etwa zwei bis drei Millimeter über die Embryonen ab. Für klare Ultraschallbilder ist es entscheidend, dass der Sondenkopf beim Hin- und Herschwingen nicht auf die Embryonen trifft.

Um Bilder zu sammeln, schließen Sie die Nadel an eine 25-Mikroliter-Mikrospritze an, die in einer manuellen Infusionsentnahmepumpe montiert ist. Setzen Sie eine abgeschrägte und geschärfte Mikroinjektionsnadel in einen Pipettenhalter ein. Üben Sie leichten Druck auf eine mit Mineralöl gefüllte 10-cm³-Spritze im oberen Teil des Absperrhahns aus, um Öl in den Schlauch, den Mikroinjektionsnadelhalter und die Nadel zu spülen und Öl in die Mikrospritze zu ziehen.

Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Ziehen Sie eine ein bis zwei Millimeter lange Luftblase in die Nadel zurück. Um die Trennung zwischen dem Mineralöl und dem Virus aufrechtzuerhalten, verwenden Sie die Entnahmepumpe, um die Nadel vorsichtig mit Viruslösung zu befüllen.

Ziehen Sie die Lösung sanft und langsam auf und achten Sie darauf, Verstopfungen zu vermeiden. Platzieren Sie die geladene Nadel in der Position des Mikrom-Manipulators im Injektionsbereich. Achten Sie darauf, dass es nicht an den Embryonen oder der Ultraschallsonde zerbricht.

Bringen Sie die Injektionsnadel ein bis zwei Millimeter von der Gebärmutterwand entfernt in Position. In einem Winkel von etwa 45 Grad werden die von der Ultraschallsonde erzeugten Bilder auf einem Videomonitor visualisiert. Die Nadelspitze wird als hellster Punkt auf dem Bildschirm angezeigt.

Achten Sie darauf, dass die Schwingungsrichtung der Sonde parallel zur Länge der Nadel verläuft. Positionieren Sie den Embryo anhand des Ultraschallbildes auf dem Videomonitor so, dass die Zielregion, in diesem Fall die vier Hirnkammern, für die Nadel gut sichtbar und zugänglich ist. Richten Sie die Zielregion des Gehirns mit der Richtung des Nadelvorschubs aus.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Spitze der Nadel so zu bringen, dass sie gerade die Gebärmutterwand berührt. Stoße die Nadel schnell nach vorne, um in das Gebärmuttergewebe einzudringen. Mehrere ähnliche Injektionen können erforderlich sein, um die Fruchtblase zu durchdringen und dem Gehirn die entsprechende Virusmenge in den Embryo zu injizieren.

Bei einer erfolgreichen Injektion dringt ein partikulärer Schleier in den Ventrikel ein und der Ventrikelraum kann sich leicht ausdehnen, ziehen Sie die Nadel etwa fünf Millimeter zurück, bevor Sie den nächsten Embryo injizieren. Wenn beide Embryonen injiziert wurden, ziehen Sie mit einer Pinzette die nächsten beiden Embryonen durch die Scholastimembran und bringen Sie die injizierten Embryonen wieder in den Bauch zurück. Sobald die gewünschte Anzahl von Embryonen injiziert und zurück in die Bauchhöhle geschoben wurde, bewegen Sie die Maus aus dem Injektionsstadium auf ein saugfähiges Pad.

Um den Schnitt zu schließen, lassen Sie das Tier in einem sauberen, erwärmten Käfig sich erholen. Dieser Screenshot eines Echtzeit-Ultraschallbildes eines E 9,5-Mausembryos zeigt verschiedene anatomische Merkmale, die zur Steuerung von Injektionen verwendet werden können. Hier ist V der Ventrikel als Fruchtblase und uw die Gebärmutterwand.

Die Injektionsnadel ist der helle Punkt rechts im Bild. In diesem Bild zeigt ein Embryo, der mit dem A-P-L-A-P-exprimierenden Virus injiziert wurde, PLAP-positive viral infizierte Zellen im sich entwickelnden Gehirn. Die Expression der Reporter mehrere Wochen nach der Infektion ermöglicht die Untersuchung der Zellmorphologie und -position sowie eine klonale Analyse.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine ultraschallgesteuerte Mikroinjektion eines retroviralen Vektors in Mausembryonen in utero am Embryonaltag 9.5 durchführen können. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu handeln, da das Überleben umso wahrscheinlicher ist, je weniger Zeit die Maus während der Operation manipuliert wird. Es ist auch wichtig, daran zu denken, bei der Verwendung von biologisch gefährlichen Materialien wie retroviralen Vektoren vorsichtig zu sein.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.