Name: Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) zur Analyse dynamischer Histonmodifikationen in menschlichen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Transkriptionsfaktor-Besetzung und Genregulation.

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Diese Arbeit wird von der University of Virginia, der University of Virginia Cancer Center und The Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust unterstützt. Wir danken den James E. Darnell Lab (Rockefeller University) der Robert Ross Lab (Fordham University) für die Zell-Linien.

PLANUNG Der Tag vor einem ChIP Experiment geplant ist, sollten die Zellen kultiviert, so dass eine ausreichende Anzahl zur Verfügung steht. Angenommen, dass jeder ChIP-Assay wird ~ 1-1,5 x 10 7 Zellen benötigen. Immer Plan, sowohl die negative (IgG) und positive (Pan-Histon-Antikörper) Kontrollen und doppelte Experimente zu tun. Tipp - 2FTGH Zellen benötigt jeder ChIP Assay etwa ein 15 cm Gewebe Kulturschale bei 80% Konfluenz. TEIL 1: PREPARE Chromatin und PERFORM ChIP <ol><li> Entfernen Kulturmedien und induzieren Zellen für die Zeiten mit 20 ml 10% kosmischen Kälberserum (CCS) / DMEM mit IFN-gamma bei 5 ng / mL benötigt. Ersetzen Sie die Medien auf die induzierten Platten mit 20 ml 10% CCS / DMEM sowie. </li><li> In einer Abzugshaube, fügen Sie 540 ul 37% Formaldehyd und 20 ml Medium (1% Endkonzentration) in der 15 cm Schüssel. Tip - Tilt Platte und fügen Sie die Formaldehyd zu den Medien Pool - dann Felsplatte, um es gleichmäßig verteilt. </li><li> Lassen Vernetzung für 10 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. </li><li> Add Glycin bis 0,125 M Endkonzentration, um die Vernetzung zu stoppen. </li><li> Vakuum absaugen Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Sammeln Sie Zellen mit einem Zellschaber in ~ 7 mL PBS und kombinieren Zellen (von 6 Platten), die identisch in 50 mL konischen Rohr auf Eis behandelt wurden. </li><li> Zentrifuge (Beckman Coutler Allegra 12-R Zentrifuge) bei 1800 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten und saugen Sie den PBS. Tipp - Snap freeze das Zellpellet wenn hier anzuhalten und bei -80 ° C. </li><li> Zellpellet in 4 ml Schwellung Buffer (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Hinzufügen 1 mM DTT, Complete Protease-Inhibitoren und Chill auf Eis vor dem Gebrauch) und Transfer zu einem 15 mL konischen Rohr. Tip - Diese Schwellung Puffervolumen ist angemessen für einen 6-Platte Pooling (~ 6-9 x 10 7 Zellen). Mehr oder weniger Puffer ändern könnte die douncing Effizienz. </li><li> Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 Minuten. </li><li> Transfer-Suspension in eine vorgekühlte 15 ml douncer (Wheaton) und Dounce 20 Hübe mit Pistill A. </li><li> Transfer dounced Zellen wieder in eine 15 ml konische Röhrchen auf Eis. </li><li> Zentrifugation bei 2500 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Kernpellet (~ 200 ul von 6 Platten) in 3 mL (15 Pellet-Volumen) der Beschallung Buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS. hinzufügen Komplett-Protease-Inhibitoren und Chill auf Eis kurz vor dem Gebrauch). Tipp - Das Ultraschall Puffervolumen ist angemessen für einen 6-Platte Pooling (~ 6-9 x 10 7 Zellen). Mehr oder weniger Puffer ändern könnte die Beschallung Effizienz. </li><li> Ultraschallbad Kerne Suspension auf Eis für 10 Zyklen (20 Sekunden on/40 Sekunden aus / Einstellung der Amplitude von 8) mit einem Misonix Sonicator 3000 mit der Mikrospitze ausgestattet. Dies führt in der Regel Chromatinfragmenten durchschnittlich 200-1000 bps in der Größe. Tip - Da sonicators variieren, die Beschallung Effizienz muss empirisch ermittelt werden. Dazu nehmen Aliquots von 20 ul vor Beschallung und nach jeder Beschallung Zyklus. Hitze dieser Proben bei 65 ° C für 4 Stunden. Fügen Sie DNA-Ladepuffer und Ausführen eines Standard 1% Agarose / TBE-Gel, um DNA-Fragmente sichtbar zu machen.) </li><li> Transfer beschallt Material zu einem SS34-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 20 Minuten bei 4 ° C bei 13000 rpm in einem SS34-Rotor (Sorvall RC6 Plus-Zentrifuge), um Pellets, was ist in der Regel eine kleine Menge von Zelltrümmern. </li><li> Vorsichtig den Überstand in ein konisches 15 ml Röhrchen auf Eis. </li><li> Pre-clear, indem 360 ul Salmon Sperm DNA / Protein A oder G Agaroseperlen Gülle und Schütteln bei 4 ° C für mindestens 30 Minuten. Tipp - Dieser Schritt nimmt das Rauschen im Test, die von nicht-spezifische Bindung Ereignissen beruht. </li><li> Zentrifugation bei 1000 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten auf dem Pellet Agaroseperlen. </li><li> Transfer bereits geklärten Überstand in einen anderen 15 ml konische Röhrchen auf Eis. </li><li> Messen Sie die A260-Einheiten der pre-cleared Chromatin und die Lautstärke mit Ultraschall Buffer zu vier (4) A260-Einheiten (0,2 mg / mL davon 1 A260 Einheit = 0,050 mg / ml) Tipp - Um die A260-Einheiten zu messen, verwässern 10 ul bereits geklärten Chromatin in 190 ul DDW; blank Spektralphotometer mit 10 l Ultraschall-Puffer in 190 ul DDW. </li><li> Sparen Sie 75 ul des Chromatins (bei 4 A260-Einheiten) als Eingangs-Sample und lagern bei 20 ° C bis zu seiner Vernetzungen umkehren. Tipp - Dieser Schritt ist entscheidend für die Datenanalyse. Vernachlässigen Sie nicht auf den Eingang Aliquot nehmen. </li><li> Aliquot der vorbereiteten Chromatin auf 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf ice als 1 mL Aliquots. Tipp - Wenn hier anzuhalten, Snap einfrieren vorbereitet Chromatin auf Trockeneis und bei -80 ° C. NB: gespeichert Chromatin abbauen kann, die weniger als optimale Ergebnisse, so vermeiden, wenn möglich. </li><li> Fügen Sie die ChIP-grade-Antikörper gegen den induzierten und nicht-induzierten Proben-Sets in zweifacher Ausfertigung. Add IgG (2 g) und pan Histone H3 Antikörper (15 ul) als die negativen und positiven Kontrollen zur induzierten und nicht-induzierten Proben-Sets. Tipp - Die Menge des Antikörpers zu nutzen muss empirisch ermittelt werden oder auf der Lieferanten Produktblatt vorgeschlagenen Mengen. In der Regel 1-2 ug aus einem Chip-grade Antikörper gut funktioniert. Das entsprechende Volumen muss empirisch für Antikörper, die als Serum versorgt sind, bestimmt werden. </li><li> Rock Alle Rohre über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> TEIL 2: COLLECT Immunkomplexen <ol><li> Add 60 ul Salmon Sperm DNA / Protein A oder Protein G Agarose-Beads Gülle zu allen Rohren. Tipp: Verwenden Protein A für polyklonalen Kaninchen-Antikörper und Protein G für monoklonalen Maus-Antikörper. </li><li> Rock bei 4 ° C für mindestens 60 Minuten. </li><li> Pellet die Immunkomplexe (Agaroseperlen) durch microfuging sanft bei 2000 rpm bei 4 ° C für 3 Minuten. </li><li> Den Überstand aspirieren. </li><li> Waschen Sie die Immunkomplexe mit 1 ml jedes der folgenden Waschpuffer für 10 Minuten unter Schütteln bei 4 ° C. Microfuge für 3 Minuten bei 2000 rpm bei 4 ° C zwischen jedem Waschen und Absaugen des Überstandes. Keep Proben auf Eis gekühlt. Add PMSF kurz vor dem Gebrauch. <ul><li> Low Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> Hohe Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF </li><li> TE Wash - zwei Waschgänge mit TE-Puffer -10 mm Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF </li></ul></li><li> Entfernen Sie die letzten TE-Puffer zu waschen und die Perlen, 500 ul Elutionspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Tipp - Der Elutionspuffer sollte frisch zubereitet werden. </li><li> Vortex zu Agaroseperlen in Elutionspuffer und Wärme-Mix für 30 Minuten bei 65 ° C. Tipp - Jedes Röhrchen mindestens alle 10 Minuten während dieser 30 Minuten. </li><li> Microfuge für 30 Sekunden bei 2000 rpm und Transfer des Eluenten zu einer neuen Mikrozentrifugenröhrchen. Tipp - Während der Elution auftauen Ihre Eingabe Proben und fügen 500 ul Elutionspuffer auf jeden einzelnen. Fügen Sie diesen Proben in alle Schritte für die Zukunft. </li><li> Add 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 200 mM zu allen Proben und Wirbel. </li><li> Inkubation bei 65 ° C über Nacht (oder mindestens 4 Stunden). </li></ol> TEIL 3: PURIFY ChIP'd UND INPUT DNA <ol><li> Microfuge alle Proben für 30 Sekunden, um Kondensation an Deckeln zu sammeln. </li><li> Add 1μL von RNAse A (10 U / mL) in jedes Röhrchen und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten. </li><li> Fügen Sie 10 ul 0,5 M EDTA, 40 ul 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 ul Proteinase K (10 mg / mL) und inkubieren bei 45 ° C für 60 Minuten. Tipp Bereiten Sie einen Master-Mix dieser Reagenzien und fügen 52 ul in jedes Röhrchen. </li><li> Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert und dann Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert die Proben. </li><li> Add 2 ul Glykogen (25 ug / mL) und 0,1 Volumen 3M Na-Acetat pH 5,2 und Wirbel. </li><li> Add 2,5 Volumen 100% Ethanol und vortexen. </li><li> Inkubation bei 20 ° C über Nacht. </li></ol> TEIL 4: Entschlacken ChIP'd UND INPUT DNA FORTSETZUNG <ol><li> Microfuge Proben für mindestens 20 Minuten bei 13000 rpm bei 4 ° C zur Fällung der DNA / Glycogen Pellets. </li><li> Waschen mit DNA / Glykogen-Pellets mit 1 ml 70% Ethanol. </li><li> An der Luft trocknen Pellets oder trocknen schnell in DNA Savant Speed ​​Vakuumzentrifuge. Tip - nicht über trockenem die DNA. </li><li> Resuspendieren DNA / Glykogen-Pellets in 200 ul TE-Puffer. </li><li> DNA (1 ul) ist bereit für die Quantifizierung mittels Real-time PCR. Shop restlichen DNA bei 20 ° C. Tip - Mit mehr als 1 ul DNA kann die real-time PCR Reaktionen hemmen, so Scale-up mit Vorsicht. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: ChIP und Input DNA-Proben werden mit Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) unter Verwendung von Primern spezifisch für die Gen-Locus der Zinsen quantifiziert. Primern, die genomische Sequenz bekannt ist in angereichert werden oder fehlen in der Histon-Modifikationen zu untersuchenden können als positive und negative Kontrollen verwendet werden. Die Daten werden als Prozentsatz der Eingang vorgestellt. Die ChIP Verfahren sollte ganz sein repeated mit drei biologischen Replikaten gemeldet Veränderungen in Histon-Modifikationen sind statistisch signifikant zu gewährleisten. Es gibt mehrere wichtige Aspekte zu berücksichtigen bei der Verwendung von Echtzeit-PCR, DNA, einschließlich Primer-Design, PCR-Effizienz und der geeignete Weg, um den Prozentsatz der Ein-und Normalisierung Verfahren berechnen zu quantifizieren. Wenn Profiling Histonmodifikationen Belegung über ein Gen, muss die PCR-Effizienz werden unter allen Primerpaaren konsistent. Die real-time PCR-System Hersteller kann die erforderlichen Informationen und Unterweisungen. Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von Chromatin Immunopräzipitation während STAT1 Aktivierung des IRF1 Gen 9, ausgelöst durch IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Belegung von STAT1, RNA Polymerase II und H3K36me3 während STAT1 Aktivierung des Gens IRF1 dynamisch. (A, B, C) ​​ChIP mit α-H3K36me3, α-STAT1 und α-Pol II von Chromatin aus 2FTGH Zellen gesammelt mit IFN-γ für 30 Minuten (rote Quadrate), 1,5 Stunden (blaue Kreise), 5 Stunden (induzierte grüne Dreiecke) oder nicht-induzierten (schwarze Rauten). IgG ist der Negativ-Kontrolle (grau Kreuze). (D) Pan H3 die positive Kontrolle ist und zeigt die Histon-Belegung in den Ort in der induzierten (blaue Kreise) und nicht-induzierten Bedingungen (schwarze Rauten). Der Dip ca. -5 bp ist auf die Nukleosomen Erschöpfung, die bei Ablese-Startpunkten gefunden wird.

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</ol>

Die ChIP-Protokoll beschrieben wurde erfolgreich im Labor zum Testen mehr als zwanzig verschiedenen Histon-Modifikationen eingesetzt. Darüber hinaus haben wir Änderungen in der Belegung von Transkriptionsfaktoren charakterisiert, Histon-modifizierende Enzyme, Proteine, die Histon-Modifikationen und der RNA Polymerase II Transkription Maschinen zu erkennen, an mehreren IFN-γ induzierten Genen. Wir haben auch das Verfahren verwendet werden, um Veränderungen in Histon-Modifikationen während der Differenzierung von Krebssta...

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/Isoamylalkohol</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Protease-Inhibitoren</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Äthanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsalz der Desoxycholsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamyl</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA-Polymerase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunopräzipitation (chip) zur assay dynamische histonmodifikationen in activated gene expression in menschlichen zellen

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In Reaktion auf eine Vielzahl von extrazellulären Liganden, die STAT (Signal Transducer und Aktivator der Transkription) Transkriptionsfaktoren werden schnell von ihren latenten Zustand im Zytoplasma an Zelloberflächenrezeptoren, wo sie durch Phosphorylierung an einem Tyrosin-Rest 1 aktiviert werden rekrutiert. Dann dimerisieren und in den Zellkern transloziert, um die Transkription von Zielgenen fahren, die sich auf Wachstum, Differenzierung, Homöostase und der Immunantwort. Es überrascht nicht, angesichts ihrer weit verbreiteten Einbindung in normale Zelle Prozesse trägt Dysregulation der STAT-Funktion, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs 2 und autoimmune Krankheiten 3. Es ist bekannt, dass die Transkription von Änderungen ist es, die Chromatin-Template 4,5 geregelt. Diese Veränderungen umfassen die Aktivitäten von ATP-abhängigen Komplexen, sowie kovalenten Histon-Modifikationen und DNA-Methylierung 6. Da STAT Aktivierung der Genexpression ist schnell und transient, bedarf es spezifische Mechanismen für die Modulation der Chromatin-Template an STAT-abhängigen Gen-Loci. So definieren Sie diese Mechanismen charakterisieren wir die Histon-Modifikationen und die enzymatischen Aktivitäten, die sie an Genorte, die STAT-Signalisierung reagieren zu generieren. Dieses Protokoll beschreibt Chromatinimmunpräzipitation, eine Methode, die wertvoll für das Studium der STAT-Signalisierung an Chromatin in aktiviert die Genexpression.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) verwendet wird, um den dynamischen Veränderungen der Chromatin-Vorlage, die Transkription von einem Signaltransduktionsweg induziert regulieren zu studieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

Als Reaktion auf eine Vielzahl extrazellulärer Liganden werden die STAT-Transkriptionsfaktoren (Signal Transducer and Activator of Transcription) schnell rekrutiert ...

Das Chip-Experiment dient der Überwachung dynamischer Veränderungen in Histonmodifikationen, die während der STAT1-aktivierten Genexpression auftreten; auf diese Weise können auch Veränderungen in der Besetzung durch Transkriptionsfaktoren, Histon-modifizierende Komplexe und die Transkriptionsmaschinerie selbst analysiert werden. Um den Assay zu beginnen, werden die Zellen mit Interferon-gamma stimuliert, um die STAT1-Signalübertragung zu aktivieren. Anschließend werden die Zellen mit Formaldehyd vernetzt und gesammelt. Danach erfolgt die Isolierung der Kerne und eine Beschallung, wodurch die Chromatinstruktur in etwa 200 bis 1000 Basenpaare lange Fragmente zerschnitten wird. Als Nächstes wird ein Antikörper hinzugefügt, der auf das gewünschte Protein oder die gewünschte Histonmodifikation abzielt, gefolgt von der Präzipitation der Immunkomplexe.Die Immunkomplexe werden gewaschen, die Vernetzungen rückgängig gemacht und die DNA gereinigt. Änderungen in histologischen Modifikationen oder die Rekrutierung von Proteinen an spezifische Bereiche eines Gens können anhand einer quantitativen Echtzeit-PCR-Analyse der immunpräzipitierten DNA bestimmt werden. Hallo, mein Name ist Lauren Borow aus dem Labor von Dr. Melissa Hendrickson und der Abteilung für Biologie an der University of Virginia.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die Chromatin-Immunpräzipitation. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um dynamische histonelle Modifikationen zu untersuchen, die während der Transkription nach der STAT1-Signalübertragung auftreten. Beginnen wir also.Am Tag vor Beginn dieses Verfahrens kultivieren Sie die Zellen, sodass eine ausreichende Anzahl für die hier verwendeten beiden FTGH-Zellen verfügbar ist. Bereiten Sie pro Chip-Assay eine 15 cm große Gewebekultur-Schale mit 80 % Konfluenz vor. Schließen Sie in jedes Experiment eine negative IgG-Kontrolle, eine positive Pan-Histon-Antikörper-Kontrolle und Duplikate ein.Um dieses Verfahren zu beginnen, entfernen Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 20 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % kosmischem Kalbserum und ergänzt mit Interferon Gamma in einer Konzentration von fünf Nanogramm pro Milliliter. Ersetzen Sie außerdem das Medium auf den nicht induzierten Platten durch 20 Milliliter 10 % C-C-S-D-M-E-M.Als Nächstes in einem Abzug arbeiten. Die 15 cm große Zellkulturschale leicht ankippen und 540 µL einer 37 %igen Formaldehydlösung zu 20 mL Medium hinzufügen. Anschließend die Schale vorsichtig schwenken, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen.Lassen Sie die Vernetzung 10 Minuten bei Raumtemperatur andauern. Geben Sie dann Glycin auf eine Endkonzentration von 125 Millimolar hinzu, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen. Entfernen Sie das Medium vorsichtig unter Vakuum und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Milliliter eiskalter PBS unter Verwendung eines Zellabstreifers. Sammeln Sie die Zellen in etwa sieben Milliliter PBS und vereinigen Sie Zellen, die identisch behandelt wurden, aus sechs 15-Zentimeter-Platten in einem 50-Milliliter-Konischgefäß auf Eis.Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen abschließend fünf Minuten lang mit 1.800 U/min bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie das PBS. Falls an dieser Stelle unterbrochen wird, schockgefrieren Sie die Zellprobe unverzüglich und lagern Sie sie nach der Vernetzung bei minus 80 Grad Celsius. Der nächste Schritt ist die Vorbereitung des Chromatins.Beginnen Sie damit, eine eisgekühlte Schwellungspufferlösung mit einem Millimolar DTT und vollständigen Proteaseinhibitoren zu versetzen. Resuspendieren Sie das Pellet aus sechs Platten in vier Milliliter der Schwellungspufferlösung und überführen Sie es in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Die Verwendung einer größeren oder geringeren Puffermenge könnte die Tanzeffizienz verändern.Inkubieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang auf Eis. Sobald die Inkubation auf Eis abgeschlossen ist, überführen Sie die Suspension in einen vorab gekühlten 15-Milliliter-Downer und „dancen“ Sie sie. Führen Sie 20 Stöße mit PEs A durch. Nach dem „Dancen“ überführen Sie die Zellen zurück in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das auf Eis steht. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 2.500 U/min und vier Grad Celsius und entfernen Sie anschließend den Überstand, wobei das nukleäre Pellet zurückbleibt.Fügen Sie vollständige Proteaseinhibitoren zum auf Eis gekühlten Sonikationspuffer hinzu. Sechs Platten ergeben etwa 200 Mikroliter nukleäres Pellet-Resuspendiermedium. Resuspendieren Sie das Pellet in 15 Pelletvolumina oder drei Milliliter des Sonikationspuffers.Die Verwendung eines abweichenden Volumens für diese Zellmenge könnte die Beschallungseffizienz verändern. Die Beschallungseffizienz sollte zuvor für das Gerät Ihres Labors bestimmt werden. Hier wird ein Miss Sonic Sonicate 3000 mit Mikrochip verwendet.Sonifizieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 Zyklen mit jeweils 20 Sekunden Einschalt- und 40 Sekunden Ausschaltzeit bei einer Amplitudeinstellung von acht. Dies führt typischerweise dazu, dass die Chromatinfragmente nach Abschluss der Sonifikation durchschnittlich eine Größe von 200 bis 1000 Basenpaaren aufweisen. Überführen Sie das sonifizierte Material in ein SS-34-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 13.000 U/min für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Im SS-34-Rotor Zelltrümmer pelletieren, was gewöhnlich eine geringe Menge darstellt. Überführen Sie das Überstand sorgfältig in ein 15-Milliliter-Konischgefäß auf Eis. Fahren Sie mit dem Anreichern fort, um den Hintergrund durch unspezifische Bindungsereignisse zu verringern.Zunächst klären Sie die Chromatinpräparation vor, indem Sie 360 Mikroliter Salmonensperma-DNA-Protein A- oder G-Agrobeads-Suspension hinzufügen und vier Grad Celsius für mindestens 30 Minuten schütteln. Zentrifugieren Sie bei 1000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Agrubeads zu pelletieren. Überführen Sie dann das vorgeklärte Supernatant in ein anderes 15-Milliliter-Konikalröhrchen auf Eis.Messen Sie anschließend die Absorption bei 260 Nanometern oder die A 260-Einheiten des Chromatins. Verdünnen Sie 10 Mikroliter Präzipitationschromatin in 190 Mikrolitern zweifach destilliertem Wasser. Für die Blindprobe mischen Sie 10 Mikroliter Sonikationspuffer mit 190 Mikrolitern zweifach destilliertem Wasser.Passen Sie das Volumen der Probe mit Sonikationspuffer auf vier A 260-Einheiten an. Heben Sie 75 Mikroliter des vorgeklärten Chromatins bei vier A 260-Einheiten als Input-Probe auf und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius, bis die Quervernetzungen aufgehoben werden. Beachten Sie, dass dieser Schritt für die Datenanalyse entscheidend ist.Vergessen Sie also nicht, den Eingabe-Aliquot zu entnehmen, und portionieren Sie die verbleibende Chromatinpräparation in 1 ml-Aliquots in 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Falls an dieser Stelle unterbrochen wird, schockgefrieren Sie das präparierte Chromatin sofort in Trockeneis und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.Jedoch, da gespeicherte Chromatin degradieren kann, ist es am besten, mit der IP fortzufahren. Fügen Sie nun die ChIP-qualitätsgerechten Antikörper den induzierten und nicht induzierten Probenansätzen hinzu, jeweils im Duplikat.Üblicherweise eignen sich ein bis zwei Mikrogramm Antikörper, die genaue Menge muss jedoch zuvor empirisch bestimmt werden. Geben Sie zwei Mikrogramm IgG und 15 Mikroliter Pan-Histon-H3-Antikörper als negative bzw. positive Kontrollen zu den induzierten und nicht induzierten Probenansätzen hinzu. Schütteln Sie außerdem alle Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius, bevor Sie nach der Übernacht-Inkubation mit den Antikörpern mit der Isolierung der Immunkomplexe fortfahren.Fügen Sie 60 µL einer Salmon-Spermien-DNA-Protein-A- oder Protein-G-Agarose-Suspension zu allen Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für mindestens 60 Minuten, um die Immunokomplexe an die Kügelchen zu binden.Pelletieren Sie die an die Agros-Perlen gebundenen Immunkomplexe durch Zentrifugation vorsichtig mit 2000 U/min für drei Minuten bei vier Grad Celsius; entfernen Sie anschließend den Überstand. Führen Sie danach eine Serie von Pufferwäschen durch, beginnend mit einer Niedrigsalzwäsche, gefolgt von einer Hochsalzwäsche und anschließend einer Lithiumchloridwäsche.Und abschließend zwei TE-Pufferwäschen für jeden der Waschpuffer. Geben Sie PMSF kurz vor der Verwendung hinzu, waschen Sie mit einem Milliliter Puffer für 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit Schütteln, zentrifugieren Sie für drei Minuten bei 2000 U/min bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand, wobei die Proben auf Eis gekühlt gehalten werden. Nach dem Entfernen des letzten TE-Pufferwaschschritts geben Sie 500 Mikroliter frisch zubereiteten Lucian-Puffer zu den Perlen, wirbeln Sie kurz, um die Aros-Perlen im Lucian-Puffer zu mischen, und inkubieren Sie für 30 Minuten bei 65 Grad Celsius.Vortexen Sie alle 10 Minuten, während die Proben eluiert werden, tauen Sie die Input-Proben auf und geben Sie 500 Mikroliter Elutionspuffer zu jeder Probe hinzu. Schließen Sie diese Proben in alle nachfolgenden Schritte ein. Sobald die Proben die Inkubation bei 65 Grad Celsius abgeschlossen haben, mikrofugen Sie sie 30 Sekunden lang bei 2000 U/min und überführen Sie das EENT in ein neues Mikrofugengefäß.Schließlich wird die Vernetzung rückgängig gemacht. Geben Sie fünf Molar Natriumchlorid zu allen Proben hinzu, um eine Endkonzentration von 200 Millimolar zu erreichen, und mischen Sie gründlich im Vortex bei 65 Grad Celsius für mindestens vier Stunden bis über Nacht. Sobald die Vernetzungen der Immunkomplexe aufgehoben sind, kann die gebundene DNA gewonnen werden, nachdem die Inkubation bei 65 Grad Celsius abgeschlossen ist.Zentrifugieren Sie die Proben kurz für 30 Sekunden. Um Kondensation an den Deckeln zu sammeln, geben Sie je einen Mikroliter RNAs A in jedes Röhrchen und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, nachdem Sie jeder Probe 10 Mikroliter 0,5 molarer EDTA, 40 Mikroliter 0,5 molarer Tris-Chlorid-pH-6,5-Pufferlösung und zwei Mikroliter Proteinase K oder insgesamt 52 Mikroliter aus einer Master-Mix-Lösung zugesetzt haben, und inkubieren Sie anschließend 60 Minuten bei 45 Grad Celsius. Extrahieren Sie die Proben mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol und danach mit Chloroform-Isoamylalkohol.Um anschließend die DNA auszufällen, geben Sie zwei Mikroliter Glykogen und 0,1 Volumina dreimolarer Natriumacetat-Lösung, pH 5,2, zu jeder Probe hinzu, wirbeln Sie gründlich und fügen Sie dann 2,5 Volumina 100 %igen Ethanol hinzu, wirbeln Sie erneut und inkubieren Sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Proben und zentrifugieren Sie sie 20 Minuten bei 13.000 U/min und vier Grad Celsius.Waschen Sie die DNA-Glykogen-Pellets mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Trocknen Sie die Pellets entweder an der Luft oder verwenden Sie eine Vakuum-Schnelltrocknungszentrifuge. Trocknen Sie die DNA nicht zu stark aus. Resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern TE-Puffer und quantifizieren Sie nicht mehr als ein Mikroliter mittels Echtzeit-PCR.Die hier gezeigten PCR-Ergebnisse stammen aus einem Chip-Experiment zur Untersuchung der Dynamik von H3K36me3. Während der Interferon-gamma-induzierten Expression des IRF1-Gens wurde ein H3K36me3-Antikörper verwendet, um Chromatin aus zwei FTGH-Zellen anzureichern, die für 30 Minuten, 1,5 Stunden und 5 Stunden mit Interferon gamma stimuliert wurden, wobei IgG als negativer Kontrollantikörper diente. Die Besetzung durch STAT1 sowie die Besetzung durch RNA-Polymerase II wurden zu denselben Zeitpunkten ebenfalls bestimmt.Die Histon-Besetzung entlang des IRF1-Genlocus wurde für die nicht induzierten und induzierten Bedingungen unter Verwendung des Pan-Histon-3-Antikörpers bestimmt, der gleichzeitig als positiver Kontrollwert dient. Die Vertiefung um minus fünf Basenpaare resultiert aus der Nukleosom-Depletion, die an Transkriptionsstartstellen zu finden ist. Soeben haben wir Ihnen die Vorgehensweise der Chromatin-Immunpräzipitation gezeigt.Dieser Test eignet sich zur Beobachtung von Chromatin-Modifikationen, die während der aktivierten Genexpression auftreten. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Fragmentierungsbedingungen für Ihr Chromatin mit Ihrem Agenz vor Beginn eines ChIP-Experiments zu optimieren. Denken Sie außerdem daran, Ihre Input-Proben zu entnehmen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biologie

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Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

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