Name: Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung, Aufzeichnung und Stimulation neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays. Diese Methode ermöglicht Langzeitstudien zur Netzwerkaktivität und Informationsverarbeitung in vitro.

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Wir möchten die Mitglieder des Potter-Gruppe für die Bereitstellung von wertvollen Kommentare über das Protokoll zu danken. ; Diese Arbeit wurde durch eine klinische Ausbildung durch Forschung Stipendium der American Academy of Neurology Foundation zu CMH, ein Stipendium des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS finanziert <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> zu JDR (GM08169) ), einen Zuschuss von der NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS054809), eine Ruth L. Kirschstein National Research Service Award für JDR (NS060392), ein NSF EFRI gewähren (0836017), der Coulter Foundation Translational Research Award, und eine translationale Forschung Stipendium für JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH hat nichts zu offenbaren.<br /&gt; JDR und SMP sind Berater für Axion Biosystems bezahlt.<br /&gt; Die Einreichung Gebühren-und Videoverarbeitung Gebühren für diesen Artikel und Video wurden uns freundlicherweise von Multi-Channel Systems gesponsert.

Dieses Protokoll zeigt Anleitungen zur Kultur und zu pflegen neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays sowie eine Einführung in die von der Aufnahme und anregende neuronale Netze. Einige der häufigsten Probleme bei der Aufnahme von MEAs wurden auch in der MEA Abschnitt zur Fehlerbehebung diskutiert. Es gibt gelegentliche Variationen in das Protokoll über diskutiert und oft sind diese Veränderungen genutzt werden, um spezifische Bedingungen durch bestimmte experimentelle Designs erforderlich zu optimieren. Obwohl die Aufnahme und anregenden hier vorgestellte System unserer maßgeschneiderten NeuroRighter 15 mit der MCS-Vorverstärker besteht, gibt es mehrere andere Systeme, die eine Schnittstelle mit der neuronalen Netze bieten kann. Die Auswahl einer bestimmten Einrichtung wird von der jeweiligen experimentellen Anforderungen ab. Simplistic Ableitung und Stimulation Beispiele wurden in diesem Protokoll vorgesehenen jedoch diese Kulturen auf MEAs verwendet werden, um Einblick in die komplexen Fragen rund um synaptische Aktivität und neuronale Netzwerk-Konnektivität zu liefern. Wie bereits erwähnt, die laufenden Arbeiten nutzt diese Technologie, um Prozesse wie zelluläre Plastizität Studie, Entwicklung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. 6-10 So zeigte eine aktuelle Publikation aus unserem Labor reproduzierbar zielgerichtet in vitro Lernen mit real-time Closed Loop Stimulation in Antwort auf aktuelle neuronales Netzwerk Aktivität 3. Obwohl MEA Kulturen sind oft heikel und delikat, dank ihrer Einfachheit und Zugänglichkeit (im Vergleich zu gesunden Tieren), bieten sie ein leistungsstarkes Modell zum Studium der neuronalen Aktivität in einem Netzwerk-Ebene.

Vorräte <ul><li> Einweg-Flasche top-Filter (150 ml, 0,2 um Porengröße; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embryonale Tag 18 timed-trächtigen Rattenweibchen </li><li> Mikroelektroden-Arrays (siehe Beschreibung im Protokoll, B1) </li><li> Mikroelektroden-Array Deckel (siehe Beschreibung im Protokoll, B3) </li><li> Nylon Zellsieb (40 um, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polypropylen konische Gefäße (steril, 15ml) </li><li> Polystyrol-Petrischalen (steril, 35 mm und 100x15mm) </li><li> Pipettenspitzen (steril, 20 &amp;mgr; l, 200 ul und 1000μl) </li><li> Serologische Pipetten (5 ml) </li></ul> Ausstattung: <ul><li> Biologische Sicherheitswerkbank / Laminarströmungshaube </li><li> Zellzähler </li><li> Zentrifuge </li><li> Container aus Eis </li><li> Präparierschere und Pinzette (sterilisiert) </li><li> Präpariermikroskop in einer Sterilbank </li><li> Handheld elektrische Pipetman </li><li> Hämazytometer </li><li> Isofluoran und Gaskammer </li><li> Lichtmikroskop </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20 &amp;mgr; l), P-200 (200 ul), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA Recording-System (siehe Beschreibung im Protokoll, D1) </li><li> Nager Guillotine </li><li> Tri-Gas-Inkubator (siehe Beschreibung in Protokoll, B15) </li><li> Thermosflasche mit Sauger in der Motorhaube befestigt </li><li> Wirbel </li><li> Wasserbad (35-37 ° C) </li></ul> Lösungen und Reagenzien: BSA-Lösung: Machen Sie 5% BSA (Sigma A-9418) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 und filtriert bei 0,2 um. Diese Lösung kann vor der Zeit vorbereitet werden und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert. Zell-Medium: Kombinieren Sie 90 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml Pferdeserum (Gibco 16050), 1 ml Natriumpyruvat (100mm, Gibco 11360), 250 ul Glutamax (Gibco 35050) und Insulin (Endkonzentration 2,5 ug / ml, Sigma I-5500) dann durch eine 0,2 um filter.22 Warm passieren und ins Gleichgewicht der Zelle Medium in den Inkubator vor dem Gebrauch. Dissection Lösung für die Vorbereitung Papain-Lösung: 23 <table border="1"><tr><td> Dissection-Lösung (100ml Lager) </td><td> Kombinieren Sie in Ordnung, Filter 0,22 um und lagern bei 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Inhalt ml </td><td> Endkonzentration (mM) </td></tr><tr><td> Doppelt destilliertem Wasser </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% Phenolrot </td><td> 0,2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M Kynurenic acid </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Diese Lösung kann vor der Zeit vorbereitet werden und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). 50 ul Aliquots schockgefroren und bei -80 ° C gelagert Ein Aliquot wird in der Laminarströmungshaube vor Beginn der Zelle Dissoziation aufgetaut. Hanks balanced salt solution: Sigma (# 4891). A 1X-Lösung in entionisiertem Wasser hergestellt, sterilfiltriert bei 0,2 um und bei 4 ° C. Hibernate-Lösung: Bereiten Sie am Tag der Kultivierung. Kombinieren Sie 98 ml L-15-Medium (Invitrogen 11415) mit 2 ml B-27 Supplement (50X, Invitrogen # 17504) und Filter bei 0,2 um. Laminin-Lösung: Bereiten Sie am Tag der Kultivierung. Verdünnen Sie 20 &amp;mgr; l von Laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 ul Zellmedium für eine Endkonzentration von 0.02mg/ml. 20 pl-Aliquots der Laminin (1mg/ml) werden bei -80 ° C gelagert und unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut. Das Auftauen sollte auf der Tischplatte auftreten und nicht im Wasserbad so schnell auftauen kann manchmal zu einer Gelierung der Laminin führen. Papain-Lösung: 23 Warm 10 ml Dissektion Lösung (oben) auf 30-32 ° C. Add 200 Einheiten Papain (Sigma P-4762) und 1,6 mg L-Cystein (Sigma C-7880). Der pH-Wert auf 7,4 mit etwa 14 ul 0,1 N NaOH. Inkubieren für ca. 30 Minuten, bis die Lösung clOhren-, Filter 0,2 um, Flash-Freeze mit flüssigem Stickstoff in 2 ml Aliquots in 15 ml Polypropylen sterile konische Gefäße und bei -80 ° C. Tauwetter ein Aliquot bei 35-37 ° C vor dem Start-Protokoll. Polyethylenimin (PEI)-Lösung: 13 100 ul des PEI (50% w / v, Sigma P-3143) wird in 100 ml Natriumborat-Puffer (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) für eine endgültige Konzentration von 0,05% w / v. verdünnt Sterilfilter mit 0,2 um. Dies kann im Voraus zubereitet werden und bei 4 ° C über Monate. Sterile de-ionisiertes Wasser: Autoclave und lassen auf Raumtemperatur abkühlen vor zu bedienen. Trypsin (0,25% mit EDTA, Gibco 25200): 1ml Aliquots schockgefroren und bei -80 ° C gelagert Aliquots werden in die 35-37 ° C Wasserbad vor Gebrauch aufgetaut.

wie kultur, record und stimulieren neuronale netze auf micro-elektroden arrays (meas)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Für die letzten Jahrhunderts haben viele Neurowissenschaftler auf der ganzen Welt ihr Leben zu verstehen, wie neuronale Netzwerke gewidmet und warum sie stoppen bei verschiedenen Krankheiten arbeiten. Studien haben neuropathologischen Beobachtung, Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen Kennzeichnung und intrazelluläre Aufnahme in beiden dissoziierten Neuronen und in Scheiben schneiden Vorbereitungen einbezogen. Dieses Protokoll beschreibt eine andere Technologie, die wachsende dissoziierten neuronalen Kulturen auf Micro-Elektroden Arrays (auch als Multi-Elektroden-Arrays, MEAs) beinhaltet. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung dieses Systems gegenüber anderen Technologien. Dissoziierten neuronalen Kulturen auf MEAs bieten ein vereinfachtes Modell, in dem Netzwerk-Aktivität mit elektrischer Stimulation Sequenzen durch die Arrays mehrere Elektroden manipuliert werden können. Da das Netzwerk klein ist, ist die Wirkung der Stimulation auf beobachtbare Bereiche, die nicht der Fall ist in der intakten Präparate begrenzt. Die Zellen wachsen in einer Monoschicht Änderungen in der Morphologie leicht mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu überwachen. Schließlich können Kulturen auf MEAs über ein Jahr lang in vitro, die eine klare zeitliche Beschränkungen, die mit anderen Kultivierungsmethoden entfernt überleben. 1 Unser Labor und andere rund um den Globus nutzen diese Technologie, um wichtige Fragen zu neuronalen Netzen zu fragen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs bieten. In-vitro-Netzwerke bieten eine Möglichkeit für Fragen physiologisch relevanten Fragen bei der Netzwerk-und zellulärer Ebene, was zu einem besseren Verständnis der Gehirn Funktion und Dysfunktion.

Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs.<em&gt; In-vitro-</em&gt; Netzwerke bieten eine Möglichkeit für Fragen physiologisch relevanten Fragen bei der Netzwerk-und zellulärer Ebene führt zu einem besseren Verständnis der Hirnfunktion und Dysfunktion.

Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays zu kultivieren, aufzuzeichnen und zu stimulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Reagenzien und Mikroelektrodenarrays für die Kultivierung vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, kortikale Neuronen von einem Rattenembryo am Tag 18 zu dissoziieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Neuronen zwei bis drei Wochen lang auf Mikroelektrodenarrays zu plattieren und zu kultivieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, mit den neuronalen Netzwerken durch Stimulation und Aufzeichnung von den Mikroelektrodenarrays zu experimentieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die spontane und reizevozierte Aktivität in neuronalen Netzwerken mit Aufzeichnungs- und Stimulationssoftware durch akribische Zellkultivierung auf Mikroelektrodenarrays zeigen.Hallo, ich bin Professor Steve Potter. Ich bin Direktor des Labors für Neurotechnik am Kulturinstitut für Biomedizintechnik an der Georgia Tech. Diese Abteilung wird mit der Emory University School of Medicine geteilt.Und ich bin Chad Hales, ein Postdoc in Dr. Potters Labor. Ich bin auch Fellow für kognitives Verhalten in der Abteilung für Neurologie an der Emory University School of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie Neuronen auf Multi-Elektroden-Arrays kultivieren und pflegen können.So wie diese. Wir verwenden sie, um Lernen und Gedächtnis in vitro und die Informationsverarbeitung im Netzwerk zu untersuchen. Fangen wir also an: Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Mikroelektrodenarrays oder der MEA-Pipette von Multichannel Systems 100 Mikroliter Polyethylenamin in die Mitte eines sauberen und sterilen MEA, das in einer 100-Millimeter-Petrischale ruht, um eine Beschädigung der Elektroden zu vermeiden.Berühren Sie niemals feste Gegenstände mit der MEA-Oberfläche. Die Schale leicht mit einem sterilen Deckel abdecken, der mit einer gasdurchlässigen Teflonmembran versehen ist, und 30 Minuten in der Haube inkubieren. Der Teflon-Membrandeckel sorgt für einen gasförmigen Austausch mit minimaler Verdunstung und die Möglichkeit, in Umgebungen mit geringerer Luftfeuchtigkeit zu kultivieren.Die geringere Luftfeuchtigkeit ermöglicht den Einsatz empfindlicher Elektronik im Inkubator und reduziert die Kontaminationsrate. Aspirieren Sie das PEI und spülen Sie das MEA dreimal mit ein bis zwei Millilitern sterilem entionisiertem Wasser ab. Lassen Sie sie bei abgenommenem Deckel in der Haube mindestens 30 Minuten trocknen oder bis sie vollständig trocken sind.Führen Sie eine Dissoziation des kortikalen Neurons E 18 durch, wie im Textteil dieses Protokolls beschrieben. Die Zellen nach dem Abseihen abseihen. Füllen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und bringen Sie das Volumen der Zellsuspension vorsichtig mit Zellmedium auf vier Milliliter.Schichten Sie 500 Mikroliter einer 5%igen BSA-Lösung sechs Minuten lang bei 200 g unter die Zellsuspensionszentrifuge. Während sich die Zellen drehen, überprüfen Sie, ob das MEA vollständig trocken ist. Pipettieren Sie vorsichtig 20 Mikroliter Laminatlösung in die Mitte des MEA.Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen und stellen Sie sicher, dass alle Elektroden bedeckt sind. Setzen Sie den Teflondeckel vorsichtig auf den MEA, um eine Verdunstung des Laminins zu verhindern. Der MEA sollte sich auf einer völlig ebenen Fläche befinden, wenn der Deckel aufgesetzt wird.Andernfalls kann der Druck den Glasboden des Arrays zerbrechen. Inkubieren Sie das Gericht 20 Minuten lang bei 35 bis 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, 9 % Sauerstoff und 65 % Luftfeuchtigkeit. Übertragen Sie nun die gesponnenen Zellen in die Haube.Am Boden des Rohres sollte ein Zellpellet sichtbar sein. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie ihn für den Fall einer unvollständigen Pelletierung auf. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig.Zählen Sie die Anzahl der Zellen in 10 Mikrolitern der Suspension auf einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Suspension auf die gewünschte Konzentration. Typischerweise 1000 bis 3000 Zellen pro Mikroliter mit Zellmedium. Wenn die Laminatinkubation des Arrays abgeschlossen ist, saugen Sie das Tröpfchen sofort ab.Pipettieren Sie 15 bis 20 Mikroliter der Zellsuspension über den laminierten beschichteten Bereich des MEA. Decken Sie die Schale mit dem Teflondeckel ab und stellen Sie sie für 30 Minuten in den Inkubator. Untersuchen Sie die Schale unter einem Phasenkontrastmikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen anhaften und alle Elektroden bedeckt sind.Wenn die Abdeckung unvollständig ist, fügen Sie weitere Zellen hinzu und inkubieren Sie erneut. Fluten Sie die Schale langsam mit einem Milliliter erwärmtem äquilibrierendem Zellmedium. Setzen Sie den Teflondeckel wieder auf und stellen Sie die Schale für 24 Stunden wieder in den Inkubator.Am nächsten Tag. Überprüfen Sie unter dem Phasenkontrastmikroskop, ob die kultivierten Zellen haften und ob die Menge an Schmutz und Zelltod bei richtiger Pflege und Fütterung begrenzt wird. Wie im Begleittext erläutert, können auf diese Weise kultivierte Neuronen mehr als ein Jahr überleben.Nach zwei bis drei Wochen haben die Kulturen einen stetigen Aktivitätszustand erreicht und können aus diesem Video aufgezeichnet werden. Bringen Sie die Schüssel wieder in den Aufnahmeinkubator, der bei 35 bis 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, 9 % Sauerstoff und 65 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Um die ideale Temperatur und den idealen pH-Wert aufrechtzuerhalten, sollten Sie die Schale beim Bewegen parallel zum Boden tragen und schnelle Bewegungen vermeiden, die die Zellen vom Substrat lösen könnten.Heben Sie den MEA aus der Schüssel und setzen Sie ihn in die Mehrkanalsysteme ein. Nehmen Sie einen Preem-Verstärker auf, wobei darauf zu achten ist, dass die interne Masse richtig mit der Masse des Preem-Verstärkers abgestimmt ist. Der Vorverstärker sitzt auf einem Pelzgerät, das zur Wärmeableitung fungiert wie im Begleittext hier beschrieben, der Vorverstärker wurde aus dem Inkubator herausgefahren.Zeigen Sie besser die richtige Sitzgelegenheit der Schüssel. Verwenden Sie ein mit 70 % Ethanol angefeuchtetes Tuch, um die Kontakte um den Umfang des Arrays herum zu reinigen. Vergewissern Sie sich, dass der MEA richtig unten sitzt, und verriegeln Sie den Deckel.Verwenden Sie bei Bedarf ein Wattestäbchen, um die Kontakte des Arrays auszurichten. Wählen Sie in Neuro Writer die für das Experiment geeigneten Einstellungen aus. Der Aufnahmeschalter muss hochgeklappt werden.Um die Daten in eine Datei zu schreiben, klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Aufzeichnung zu starten. Der Spike-Bildschirm zeigt nun laufende Aktivitätsspuren und Hintergrundgeräusche mit gelegentlichen Aktionspotenzialen und Aktivitätsspitzen an. Wenn eine Elektrode zu viel Rauschen aufweist, kann sich ein falsch ausgerichteter Stift auf dem Deckel des Vorverstärkers, ein kleines Stück Müll, ein Tropfen Medium, eine verschlechterte Elektrodenoberfläche oder eine überlappende durchsichtige Membran vom Deckel befinden, die den Kontakt stört.Überprüfen Sie den Kontaktstift und stellen Sie ihn bei Bedarf mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Wattestäbchen ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Spike-Wellenform, um die Bildschirmansicht in den Spike-Erkennungsmodus zu ändern, in dem Aktionspotentiale in statischen, drei Millisekunden langen Fenstern angezeigt werden. Um das neuronale Netzwerk auf dem MEA zu stimulieren, trainieren Sie den Salpa-Algorithmus auf der Registerkarte Aufnahmeeinstellungen, um das Stimulationsartefakt zu begrenzen, aktivieren Sie salpa auf der Registerkarte Online-Einstellungen.Sobald die Aufnahme gestartet ist, klicken Sie auf die Registerkarte STEM, um ein geeignetes Stimulationsparadigma einzurichten, um das Open-Loop-Programm zur Stimulation einer Elektrode zu verwenden und die Reaktionen in der Schüssel zu beobachten. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen im Open-Loop-Bereich aus und drücken Sie dann auf Start. Visualisieren Sie Antworten auf der Registerkarte "Haupt-Spikes" und der Registerkarte "Spike-Wave-Formulare".Dieser Film zeigt die Entwicklung von in vitro Day-Seven-Neuronen und Gliazellen, während sie wachsen und ein verbundenes Netzwerk auf einem MEA bilden, damit Mikroelektroden sichtbar sind. Dies ist ein Rasterdiagramm von zwei Minuten spontaner Aktivität eines neuronalen Netzwerks. Jeder schwarze Punkt steht für ein Aktionspotential.Zwei Aktivitätsspitzen werden mit den blauen Pfeilen angezeigt. Das Ansprechverhalten über mehrere Elektroden ist eine Funktion der Netzwerkkonnektivität. Hier ist ein Rasterdiagramm von 16 Sekunden stimulusevozierter Aktivität.Rote Sterne stehen für Reize. Die roten Pfeile zeigen fünf Stimuli, die erfolgreich synaptische Aktivitätsausbrüche über mehrere Elektroden hinweg induzierten. Gelegentlich führt ein Stimulus nicht zu einem Ausbruch.Hier auf dem blauen Pfeil haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays kulturell aufzeichnen und stimulieren können. Das wahrscheinlich Wichtigste, worüber man sich Sorgen machen muss, ist, eine Infektion der Kulturen zu verhindern und die Verdunstung zu reduzieren. Wenn Sie solche Deckel mit semipermeablen Membranen verwenden, sind sie versiegelt und verhindern Verdunstung und Infektion, und Sie können die Kulturen möglicherweise monatelang, vielleicht sogar mehr als ein Jahr, kultivieren.Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine robuste Art und Weise die neuronale Lawinen, dh skaleninvarianten räumlich-zeitliche Aktivitätsmuster platzt, was auf kritischen Zustand Dynamik in Kortex zu untersuchen. Lawinen entstehen spontan bei der Entwicklung von oberflächlichen Schichten der kultivierten Cortex, die für die langfristige Messungen der Aktivität ermöglicht mit planaren integrierten Multi-Elektroden-Arrays (MEA) unter genau kontrollierten Bedingungen.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

Dieses Video zeigt die Entwicklung einer 3D-Neuronenkultur, die mit einem planaren Mikroelektrodenarray mit Hippocampus-Neuronen gekoppelt ist. Die isolierten Neuronen bilden ein 2D-Netzwerk auf der aktiven Fläche des Mikroelektrodenarrays und haften an Glasmikrokügelchen in einer Multi-Well-Platte mit einem Membraneinsatz. Nach der Übertragung dieser mit Neuronen beschichteten Mikrokügelchen auf die Elektrode organisieren sie sich zu einem miteinander verbundenen neuronalen 3D-Netzwerk.

Aufbau dreidimensionaler neuronaler Netzwerke, die an Mikroelektrodenarrays gekoppelt sind

Das Video zeigt, wie man ein Mikroelektrodenarray (MEA) verwendet, um die elektrophysiologische Aktivität von Neuronen aufzuzeichnen, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) stammen. Die elektrophysiologische Aktivität eines Multiwell-MEA, das eine Neuron-Astrozyten-Co-Kultur enthält, wird aufgezeichnet, um Aktionspotentiale von mehreren Neuronen im Netzwerk zu detektieren und die erfolgreiche Differenzierung von hiPSCs in Neuronen zu bestätigen.

Messung der elektrophysiologischen Aktivität neuronaler Netzwerke mit Hilfe von Mikroelektrodenarrays

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung spontaner und stimulationsabhängiger neuronaler Aktivität von primären murinen Spiralganglion Neuron (SGN)-Kulturen auf einem Multielektrodenarray (MEA). Es beinhaltet das Waschen und Vorbereiten des MEA, das Aufzeichnen spontaner neuronaler Aktivität und das Anwenden kontrollierter elektrischer Stimuli, um stimulationsabhängige neuronale Aktivität zu identifizieren.

Analyse der neuronalen Aktivität in primären Maus-Spiralganglien-Neuronen mit Hilfe von Multielektroden-Arrays

Dieses Video zeigt elektrophysiologische Aufzeichnungen von organotypischen Co-Kulturen von Rückenmarksschnitten, die mit einem Multi-Elektroden-Array oder MEA-Gerät aufgenommen wurden. Diese Aufzeichnungen beurteilen die neuronale Regeneration zwischen den Schnitten. Die beobachtete synchronisierte elektrische Aktivität bestätigt die erfolgreiche neuronale Regeneration.

Elektrophysiologische Aufzeichnungen zur Beurteilung neuronaler Regenerationen in co-kultivierten Rückenmarksschnitten

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verwendung des Multielektroden-Arrays (MEA) zur Messung der synaptischen Physiologie in 3D-Kokultur-Sphären. Diese Methode ermöglicht es, die Dynamik des neuronalen Netzwerks und die Burst-Aktivität des synaptischen Netzwerks in den 3D-Sphären zu verstehen.

Verwendung von Multielektroden-Arrays zur Messung der synaptischen Physiologie in 3D-Kokulturkugeln

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Neuron-Astrozyten-Co-Kultur zur Aufzeichnung der Aktivität neuronaler Netzwerke. Nach der Etablierung der Co-Kultur von Motoneuronen und Astrozyten auf einer Multi-Elektroden-Array-Platte (MEA) wurde die synchrone rhythmische elektrische Aktivität des neuronalen Netzwerks extrazellulär mit dem MEA aufgezeichnet.

Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität des neuronalen Netzwerks in einer Neuron-Astrozyten-Kokultur

In dieser Arbeit wird ein neuartiges experimentelles Modell, in dem 3D-Neuronenkulturen an planare Mikroelektrodenarrays (MEAs) gekoppelt sind, presented. 3D Netzwerke aufgebaut werden, indem Neuronen in ein Gerüst aus Glasmikrokügelchen eingepflanzt werden, auf dem Neuronen wachsen und miteinander verbundene 3D-Strukturen bilden.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kultivierung primärer Maus-Spiralganglien-Neuronenexplantate auf Multi-Elektroden-Arrays, um neuronale Reaktionsprofile zu untersuchen und Stimulationsparameter zu optimieren. Solche Studien zielen darauf ab, die Neuron-Elektroden-Grenzfläche von Cochlea-Implantaten zu verbessern, um das Gehör der Patienten sowie den Energieverbrauch des Geräts zu verbessern.

Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

Maus-neuronale Zellen, die auf Multi-Elektroden-Arrays kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach elektrischer Stimulation. Dieses Protokoll demonstriert, wie man Neuronen kultiviert, wie man Aktivität aufnimmt und wie man ein Protokoll aufbaut, um die Netze zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Dieses Protokoll soll zeigen, wie in-vitro- Mikroelektrode Arrays mit mikrofluidischen Geräten für das Studium Aktionspotential Übertragung in neuronalen Kulturen zu verbinden. Datenanalyse, nämlich die Erkennung und Charakterisierung von Aktionspotentiale, Vermehrung ist durchgeführt mit einem neuen, erweiterten, aber benutzerfreundlich und frei verfügbar, computational Tool.

Interfacing Mikrofluidik mit Mikroelektrode Arrays für das Studium neuronale Kommunikation und axonalen Signalausbreitung

Lernen Sie die Kultivierung, Aufzeichnung und Stimulation neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays. Diese Methode ermöglicht Langzeitstudien zur Netzwerkaktivität und Informationsverarbeitung in vitro.

Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

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