Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays zu kultivieren, aufzuzeichnen und zu stimulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Reagenzien und Mikroelektrodenarrays für die Kultivierung vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, kortikale Neuronen von einem Rattenembryo am Tag 18 zu dissoziieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Neuronen zwei bis drei Wochen lang auf Mikroelektrodenarrays zu plattieren und zu kultivieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, mit den neuronalen Netzwerken durch Stimulation und Aufzeichnung von den Mikroelektrodenarrays zu experimentieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die spontane und reizevozierte Aktivität in neuronalen Netzwerken mit Aufzeichnungs- und Stimulationssoftware durch akribische Zellkultivierung auf Mikroelektrodenarrays zeigen.

Hallo, ich bin Professor Steve Potter. Ich bin Direktor des Labors für Neurotechnik am Kulturinstitut für Biomedizintechnik an der Georgia Tech. Diese Abteilung wird mit der Emory University School of Medicine geteilt.

Und ich bin Chad Hales, ein Postdoc in Dr. Potters Labor. Ich bin auch Fellow für kognitives Verhalten in der Abteilung für Neurologie an der Emory University School of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie Neuronen auf Multi-Elektroden-Arrays kultivieren und pflegen können.

So wie diese. Wir verwenden sie, um Lernen und Gedächtnis in vitro und die Informationsverarbeitung im Netzwerk zu untersuchen. Fangen wir also an: Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Mikroelektrodenarrays oder der MEA-Pipette von Multichannel Systems 100 Mikroliter Polyethylenamin in die Mitte eines sauberen und sterilen MEA, das in einer 100-Millimeter-Petrischale ruht, um eine Beschädigung der Elektroden zu vermeiden.

Berühren Sie niemals feste Gegenstände mit der MEA-Oberfläche. Die Schale leicht mit einem sterilen Deckel abdecken, der mit einer gasdurchlässigen Teflonmembran versehen ist, und 30 Minuten in der Haube inkubieren. Der Teflon-Membrandeckel sorgt für einen gasförmigen Austausch mit minimaler Verdunstung und die Möglichkeit, in Umgebungen mit geringerer Luftfeuchtigkeit zu kultivieren.

Die geringere Luftfeuchtigkeit ermöglicht den Einsatz empfindlicher Elektronik im Inkubator und reduziert die Kontaminationsrate. Aspirieren Sie das PEI und spülen Sie das MEA dreimal mit ein bis zwei Millilitern sterilem entionisiertem Wasser ab. Lassen Sie sie bei abgenommenem Deckel in der Haube mindestens 30 Minuten trocknen oder bis sie vollständig trocken sind.

Führen Sie eine Dissoziation des kortikalen Neurons E 18 durch, wie im Textteil dieses Protokolls beschrieben. Die Zellen nach dem Abseihen abseihen. Füllen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und bringen Sie das Volumen der Zellsuspension vorsichtig mit Zellmedium auf vier Milliliter.

Schichten Sie 500 Mikroliter einer 5%igen BSA-Lösung sechs Minuten lang bei 200 g unter die Zellsuspensionszentrifuge. Während sich die Zellen drehen, überprüfen Sie, ob das MEA vollständig trocken ist. Pipettieren Sie vorsichtig 20 Mikroliter Laminatlösung in die Mitte des MEA.

Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen und stellen Sie sicher, dass alle Elektroden bedeckt sind. Setzen Sie den Teflondeckel vorsichtig auf den MEA, um eine Verdunstung des Laminins zu verhindern. Der MEA sollte sich auf einer völlig ebenen Fläche befinden, wenn der Deckel aufgesetzt wird.

Andernfalls kann der Druck den Glasboden des Arrays zerbrechen. Inkubieren Sie das Gericht 20 Minuten lang bei 35 bis 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, 9 % Sauerstoff und 65 % Luftfeuchtigkeit. Übertragen Sie nun die gesponnenen Zellen in die Haube.

Am Boden des Rohres sollte ein Zellpellet sichtbar sein. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie ihn für den Fall einer unvollständigen Pelletierung auf. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig.

Zählen Sie die Anzahl der Zellen in 10 Mikrolitern der Suspension auf einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Suspension auf die gewünschte Konzentration. Typischerweise 1000 bis 3000 Zellen pro Mikroliter mit Zellmedium. Wenn die Laminatinkubation des Arrays abgeschlossen ist, saugen Sie das Tröpfchen sofort ab.

Pipettieren Sie 15 bis 20 Mikroliter der Zellsuspension über den laminierten beschichteten Bereich des MEA. Decken Sie die Schale mit dem Teflondeckel ab und stellen Sie sie für 30 Minuten in den Inkubator. Untersuchen Sie die Schale unter einem Phasenkontrastmikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen anhaften und alle Elektroden bedeckt sind.

Wenn die Abdeckung unvollständig ist, fügen Sie weitere Zellen hinzu und inkubieren Sie erneut. Fluten Sie die Schale langsam mit einem Milliliter erwärmtem äquilibrierendem Zellmedium. Setzen Sie den Teflondeckel wieder auf und stellen Sie die Schale für 24 Stunden wieder in den Inkubator.

Am nächsten Tag. Überprüfen Sie unter dem Phasenkontrastmikroskop, ob die kultivierten Zellen haften und ob die Menge an Schmutz und Zelltod bei richtiger Pflege und Fütterung begrenzt wird. Wie im Begleittext erläutert, können auf diese Weise kultivierte Neuronen mehr als ein Jahr überleben.

Nach zwei bis drei Wochen haben die Kulturen einen stetigen Aktivitätszustand erreicht und können aus diesem Video aufgezeichnet werden. Bringen Sie die Schüssel wieder in den Aufnahmeinkubator, der bei 35 bis 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, 9 % Sauerstoff und 65 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Um die ideale Temperatur und den idealen pH-Wert aufrechtzuerhalten, sollten Sie die Schale beim Bewegen parallel zum Boden tragen und schnelle Bewegungen vermeiden, die die Zellen vom Substrat lösen könnten.

Heben Sie den MEA aus der Schüssel und setzen Sie ihn in die Mehrkanalsysteme ein. Nehmen Sie einen Preem-Verstärker auf, wobei darauf zu achten ist, dass die interne Masse richtig mit der Masse des Preem-Verstärkers abgestimmt ist. Der Vorverstärker sitzt auf einem Pelzgerät, das zur Wärmeableitung fungiert wie im Begleittext hier beschrieben, der Vorverstärker wurde aus dem Inkubator herausgefahren.

Zeigen Sie besser die richtige Sitzgelegenheit der Schüssel. Verwenden Sie ein mit 70 % Ethanol angefeuchtetes Tuch, um die Kontakte um den Umfang des Arrays herum zu reinigen. Vergewissern Sie sich, dass der MEA richtig unten sitzt, und verriegeln Sie den Deckel.

Verwenden Sie bei Bedarf ein Wattestäbchen, um die Kontakte des Arrays auszurichten. Wählen Sie in Neuro Writer die für das Experiment geeigneten Einstellungen aus. Der Aufnahmeschalter muss hochgeklappt werden.

Um die Daten in eine Datei zu schreiben, klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Aufzeichnung zu starten. Der Spike-Bildschirm zeigt nun laufende Aktivitätsspuren und Hintergrundgeräusche mit gelegentlichen Aktionspotenzialen und Aktivitätsspitzen an. Wenn eine Elektrode zu viel Rauschen aufweist, kann sich ein falsch ausgerichteter Stift auf dem Deckel des Vorverstärkers, ein kleines Stück Müll, ein Tropfen Medium, eine verschlechterte Elektrodenoberfläche oder eine überlappende durchsichtige Membran vom Deckel befinden, die den Kontakt stört.

Überprüfen Sie den Kontaktstift und stellen Sie ihn bei Bedarf mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Wattestäbchen ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Spike-Wellenform, um die Bildschirmansicht in den Spike-Erkennungsmodus zu ändern, in dem Aktionspotentiale in statischen, drei Millisekunden langen Fenstern angezeigt werden. Um das neuronale Netzwerk auf dem MEA zu stimulieren, trainieren Sie den Salpa-Algorithmus auf der Registerkarte Aufnahmeeinstellungen, um das Stimulationsartefakt zu begrenzen, aktivieren Sie salpa auf der Registerkarte Online-Einstellungen.

Sobald die Aufnahme gestartet ist, klicken Sie auf die Registerkarte STEM, um ein geeignetes Stimulationsparadigma einzurichten, um das Open-Loop-Programm zur Stimulation einer Elektrode zu verwenden und die Reaktionen in der Schüssel zu beobachten. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen im Open-Loop-Bereich aus und drücken Sie dann auf Start. Visualisieren Sie Antworten auf der Registerkarte "Haupt-Spikes" und der Registerkarte "Spike-Wave-Formulare".

Dieser Film zeigt die Entwicklung von in vitro Day-Seven-Neuronen und Gliazellen, während sie wachsen und ein verbundenes Netzwerk auf einem MEA bilden, damit Mikroelektroden sichtbar sind. Dies ist ein Rasterdiagramm von zwei Minuten spontaner Aktivität eines neuronalen Netzwerks. Jeder schwarze Punkt steht für ein Aktionspotential.

Zwei Aktivitätsspitzen werden mit den blauen Pfeilen angezeigt. Das Ansprechverhalten über mehrere Elektroden ist eine Funktion der Netzwerkkonnektivität. Hier ist ein Rasterdiagramm von 16 Sekunden stimulusevozierter Aktivität.

Rote Sterne stehen für Reize. Die roten Pfeile zeigen fünf Stimuli, die erfolgreich synaptische Aktivitätsausbrüche über mehrere Elektroden hinweg induzierten. Gelegentlich führt ein Stimulus nicht zu einem Ausbruch.

Hier auf dem blauen Pfeil haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays kulturell aufzeichnen und stimulieren können. Das wahrscheinlich Wichtigste, worüber man sich Sorgen machen muss, ist, eine Infektion der Kulturen zu verhindern und die Verdunstung zu reduzieren. Wenn Sie solche Deckel mit semipermeablen Membranen verwenden, sind sie versiegelt und verhindern Verdunstung und Infektion, und Sie können die Kulturen möglicherweise monatelang, vielleicht sogar mehr als ein Jahr, kultivieren.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.