IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

In den IP-FCM-Experimenten werden Proteinkomplexe auf Kügelchen eingefangen, um die verschiedenen Proteine, die miteinander interagieren, zu identifizieren und zu untersuchen. Zunächst wird ein immunpräzipitierender Antikörper, der spezifisch für das interessierende Protein ist, kovalent an Polystyrol-Latexkügelchen gekoppelt. In einem zweiten Schritt werden diese Kügelchen mit Zelllysaten inkubiert, so dass das spezifische Protein und die interagierenden Proteine an die Kügelchen binden können.

Die Kügelchen zusammen mit den eingefangenen Proteinen und dann gewaschen und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern untersucht, die spezifisch für verschiedene Moleküle sind, die mit dem immungefällten Protein assoziiert sein können. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Kügelchen durch Durchflusszytometrie analysiert, um festzustellen, welche Proteine vorhanden sind, auf denen Sie in den eingefangenen Komplexen nicht vorhanden sind. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der Immunpräzipitation, gefolgt von Western Blotting, besteht darin, dass I-P-F-C-M die Beurteilung nativer Proteinprotein-Wechselwirkungen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Probengrößen erforderlich sind.

I-P-F-C-M kann ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erzeugen, selbst wenn nur sehr wenig Biomaterial für die Analyse zur Verfügung steht, da es mit kleinen Volumina und niedrigen Konzentrationen von Analyten durchgeführt werden kann. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die folgenden Puffer vor: MES-Kopplung, Pufferabschreckung, Blockierungspuffer, QBS und Durchflusszytometrie oder FCM-Puffer. Bestimmen Sie die Konzentration der Carboxylat-modifizierten Polystyrol-Latexkügelchen oder CML-Kügelchen, indem Sie sie in PBS verdünnen und mit einem Hämozytometer zählen.

Sobald die Konzentration der Kügelchen bestimmt ist, pipettieren Sie 18 mal 10 zu den sechs Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Kügelchen zwei- bis dreimal in 0,5 bis einem Milliliter MES-Kupplungspuffer und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 20.000-facher Schwerkraft. Nach jedem Waschen während des Zentrifugierens der Kügelchen.

Bereiten Sie frischen e dac MES-Puffer für die Aktivierung der Kügelchen vor. Bewahren Sie den Puffer nach Abschluss der Wäschen entweder bei Raumtemperatur oder auf Eis auf. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern des MES-Kupplungspuffers.

Geben Sie dann 20 Mikroliter EEC MES in die Raupensuspension. Um die Carboxylgruppen auf den Kügelchen zu aktivieren, mischen Sie vorsichtig bei Raumtemperatur, indem Sie 15 Minuten lang kontinuierlich manuell auf und ab pipettieren. Obwohl dieser Schritt arbeitsintensiv ist, liefert diese Mischmethode nach dem Mischen die besten Ergebnisse.

Waschen Sie die aktivierten Kügelchen zwei- bis dreimal in 0,5 bis 1 Milliliter PBS Zentrifusion bei 20.000 Mal. Schwerkraft für drei Minuten bei Raumtemperatur Nach jedem Waschen nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die aktivierten Kügelchen in 50 Mikrolitern PBS, um den IP-Antikörper an die Kügelchen zu koppeln. Geben Sie 50 Mikroliter des monoklonalen IP-Antikörpers aus einer Stammkonzentration zwischen 0,2 und einem Milligramm pro Milliliter zu.

Stellen Sie sicher, dass außer dem Antikörper keine primären Amin-haltigen Moleküle vorhanden sind. Diese aminhaltigen Moleküle wie Tris oder Rinderserumalbumin konkurrieren mit dem Antikörper um die Kopplung an die Kügelchen. Mischen Sie die Bead-Antikörpersuspension auf einem vibrierenden Shaker drei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur.

Ausreichend schütteln, um ein Absetzen der Kügelchen auf dem Boden des Röhrchens zu verhindern. Nach dem Binden. Waschen Sie die Antikörper-Kabeljau-Kügelchen zwei- bis dreimal in 0,5 bis 1 Milliliter PBS-Zentrifugation bei 20.000 Mal.

Nach jedem Waschen drei Minuten lang bei Raumtemperatur erhitzen. Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern QBS-Puffer. Die Kopplung von monoklonalen Antikörpern an CML-Kügelchen kann durch Färben der Kügelchen mit flurokonjugierten Antikörpern gegen IgG überprüft werden.

Nach der FCM-Analyse können die mit dem monoklonalen Antikörper beschichteten Kügelchen bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis sie in einem IP-Experiment verwendet werden können. Zuerst die Kügelchen gut suspendieren, eins bis 200 bis eins bis 10.000 in PBS verdünnen und mit einem Hämozytometer zählen. Die Konzentration muss für jede präparative Charge gemessen werden, damit die Anzahl der in jedem IP-Experiment verwendeten Kügelchen genau kontrolliert werden kann.

Bereiten Sie als Nächstes frische Eingrablösung in Wasser mit 2 % Gewicht pro Volumen vor. Fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen. Anschließend auf Eis abkühlen lassen.

Verdünnen, in 1 % Gewicht pro Volumen in frisch zubereiteter Lyse einarbeiten, puffern und auf Eis legen. Bestimmen Sie die Anzahl der zu lysierenden Zellen anhand der gezeigten Tabelle als Richtlinie. Die Anzahl der benötigten Zellen hängt jedoch vom interessierenden Protein ab und muss empirisch bestimmt werden.

Hier werden 30 mal 10 bis zu sechs Zellen aus einer kleinen lymphozytären Tumorzelllinie verwendet. Übertragen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen mit 20.000 Mal.

30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius Schwerkraft erhitzen und das Medium ansaugen. Fügen Sie die entsprechende Menge frisch zubereiteter Zutaten hinzu. Graben Sie den Lysepuffer in das leicht gemischte Pellet, indem Sie auf und ab pipettieren.

Lassen Sie die Zellen dann 20 Minuten lang auf Eis läusen. Es ist zu beachten, dass je nach Zelltyp und untersuchten Protein-Protein-Wechselwirkungen die Zelllysebedingungen variieren können und empirisch bestimmt werden müssen, wenn die Lyse abgeschlossen ist. Entfernen Sie die Zellkerne und unlöslichen Zelltrümmer, indem Sie das Lysat 20.000 Mal zentrifugieren.

Schwerkraft, die 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Behalten Sie das SNA und verwerfen Sie das Pellet, um das Zielprotein an die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen zu binden. Geben Sie 50.000 bis 250.000 monoklonale Antikörper-gekoppelte Kügelchen in das geklärte Lysat und pipettieren Sie vorsichtig.

Zum Mischen beträgt das Mindestvolumen an Lysat, das für ein einzelnes IP verwendet wird, fünf Mikroliter. Geben Sie das geklärte Lysat und die Perlenmischung vier Stunden lang auf ein rotierendes vertikales Rad für Nacht in einen Kühlraum, der auf eine ausreichende Geschwindigkeit eingestellt ist, um zu verhindern, dass sich die Kügelchen unter Volumenips absetzen, die Flüssigkeit kann während der Drehung am Boden des Rohrs verbleiben. Nach der Bindung des Zielproteins an den IP-Antikörper.

Fahren Sie mit der fluoreszierenden Markierung des Immunkomplexes fort. Waschen Sie die IP-Kügelchen zweimal in einem Milliliter Eis, dem sogenannten FCM-Puffer, und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Nach jeder Wäsche die Kügelchen in 100 Mikrolitern FCM-Puffer erneut suspendieren und 20 Mikroliter in jeweils fünf oder mehr aliquotieren.

1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen oder Vertiefungen einer Schornsteinbodenplatte. Beide sind hier zu sehen. Fügen Sie den Proben Fluorochrom-konjugierte monoklonale Antikörper hinzu.

Führen Sie die FCM-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers oder gemäß empirisch ermittelten Konzentrationen als Ausgangspunkt durch. 0,2 bis 1 Mikroliter Stammantikörperlösung von mindestens 0,1 Milligramm pro Milliliter pro Röhrchen oder Vertiefung zugeben und 40 Minuten auf Eis inkubieren. Waschen Sie die sondierten Kügelchen in 1,5-Milliliter-Röhrchen zweimal mit einem Milliliter eiskalt.

FCM-Puffer, Zentrifugation bei 20.000 Mal. Drei Minuten lang Schwerkraft bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach jeder Wäsche vorsichtig das Supinat, wobei Sie darauf achten, die Perlen nicht zu stören.

für einen Schornstein die Bodenplatte zweimal mit 0,2 Millilitern eiskaltem FCM-Puffer waschen und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1000-facher Schwerkraft zentrifugieren. Nach jeder Wäsche, nach jeder Wäsche. Um den Überstand von den Kügelchen zu entfernen, schnippen Sie die Platte einmal und tupfen Sie dann noch auf dem Kopf stehend alle Tropfen von den Rändern der Vertiefungen.

Das Restvolumen in jeder Vertiefung, die die Kügelchen enthält, beträgt etwa 20 Mikroliter. Suspendieren Sie die Beads in 200 Mikrolitern FCM-Puffer pro Probentransfer auf beschriftete Faxröhren. Die Proben sind nun bereit für die Durchflusszytometrie oder FCM auf Becton Dickens und Durchflusszytometern.

Entfernen Sie die Tröpfchenhülle, die den Probeneinlass oder -schluck umgeben kann. Lassen Sie den Schluck zwischen den Proben tropfen, da dies verhindert, dass Kügelchen von einer Probe zur anderen übertragen werden. Die hier verwendeten CML-Kügelchen haben einen Durchmesser von drei bis fünf Mikrometern, etwa halb so groß wie ein ruhender Mauslymphozyt.

Daher kann es erforderlich sein, die Verstärkung des Streuverstärkers und die seitliche Streuspannung manuell zu erhöhen, um die Population der Bead-Ereignisse zu ermöglichen. Um sich hier auf dem Zytometer zu registrieren, erfolgt dies mit unmarkierten oder leeren Kügelchen. Die Einstellungen im Gang werden so angepasst, dass Wulst, Dubletten und Abri vor dem Lesen ausgeschlossen werden.

Experimentelle Proben stellen sicher, dass die Fluoreszenz auf der Skala liegt. Die unmarkierten Kügelchen dienen als Negativkontrolle der Fluoreszenz und Regenbogen-Kalibrierpartikel oder RCPs können als Positivkontrolle der Fluoreszenz verwendet werden. Da RCPs kleiner sind als die CML-Kügelchen, müssen die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuung sowie die Gangposition für diese Probe möglicherweise vorübergehend geändert werden.

Nach diesen Kalibrierungen werden die negativen und positiven Fluoreszenzextreme auf einer logarithmischen Achse visualisiert. Sobald die Kalibrierung mit RCPs abgeschlossen ist, kehren Sie zu den unbeschrifteten Perleneinstellungen für Vorwärts- und Seitenstreuung zurück. Solange nur eine Fluoreszenzsonde pro Probe verwendet wird, wie im hier gezeigten Experiment, ist keine Fluoreszenzkompensation notwendig.

Erfassen und speichern Sie nun die Fluoreszenzdatendateien, die Analyse wird anschließend mit Durchflusszytometrie-Software wie cell Quest oder FlowJo durchgeführt. Hier ist das Ergebnis einer IP-FCM-Analyse der T-Zell-LY der Maus im Wert von 1%digit toin. Der TCR CD drei Nicht-Protein-Komplex wurde mit Anti-CD drei Epsilon-Kügelchen heruntergezogen.

Der eingefangene Komplex enthält signifikante Mengen an TCR beta und Co-assoziiertem CD-3-Epsilon. Es wurden Konzentrationen anderer Proteine in der Nähe des Hintergrunds nachgewiesen, die mit einer irrelevanten Immunglobulinsonde oder Antikörpern gegen die Proteine TH 1.2, CD 45 oder H zwei KD bestimmt wurden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Immunpräzipitation, gefolgt von Western Blotting, besteht darin, dass I-P-F-C-M die Beurteilung nativer Proteinprotein-Wechselwirkungen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichprobengrößen erforderlich sind. I-P-F-C-M kann auch dann hohe Signal-Rausch-Verhältnisse liefern, wenn nur sehr wenig Biomaterial für die Analyse zur Verfügung steht, da es mit kleinen Volumina und niedrigen Konzentrationen von Analyten durchgeführt werden kann.