Name: IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Lernen Sie die IP-FCM-Methode zur Analyse nativer Protein-Protein-Interaktionen mittels Immunpräzipitation und Durchflusszytometrie. Diese Technik ermöglicht hochsensitive Detektion ohne genetische Modifikation.

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Diese Arbeit wurde von den Eagles Innovation Award (Fraternal Order of Eagles) und von der Mayo Foundation unterstützt.

Hochempfindliche Detektion und quantitative Analyse von nativem Protein-Protein-Interaktionen und Multiproteinkomplexen mittels Durchflusszytometrie: ** Dieses Video-Protokoll basiert auf einem zugehörigen Publikation 1. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. Science STKE 2007 (389): pl2, 5. Juni 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Bitte klicken Sie hier, um diese Publikation zu sehen</a> . Vor Beginn der Vorbereitung der folgenden wässrigen Stammlösungen: <table><tbody><tr><td> MES Coupling Buffer: </td><td> Lagerung bei 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Abschrecken / Blocking / Storage (QBS) Buffer: </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM-Puffer: </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Bereiten Sie unmittelbar vor dem Gebrauch: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> 50 mg / mL EDAC Pulver in MES Kupplungspuffer </td></tr><tr><td> Digitonin-Lösung (2% w / v): </td><td> Lösen Sie Digitonin Pulver in dH 2 O durch Erhitzen auf 95 ° C für 5min anschließendes Abkühlen auf Eis </td></tr><tr><td> Lysis Buffer: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Digitonin-Lösung </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitoren </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Keep on ice </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Kopplung von mAb an Beads <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration der Perlen aus den gekauften Aktien durch Verdünnung in PBS und das Zählen mit einem Hämacytometer. Beginnen Sie mit einer 1:10000 Verdünnung von Perlen zum Zählen. </li><li> Pipette 18 x 10 6 Perlen in einer 1,5-ml-Reaktionsgefäß. </li><li> Waschen Sie die Kugeln von 2 bis 3 mal in 0,5 bis 1,0 mL MES-Kupplung Puffer, Zentrifugieren bei 20.000 g für 3 Minuten bei 25 ° C nach jeder Wäsche. </li><li> Resuspendieren der Beads in 50 ul MES Coupling Buffer. </li><li> Aktivieren Sie die Carboxylgruppen auf die Perlen durch Zugabe von 20 ul der frisch zubereiteten EDAC-MES. </li><li> Vorsichtig mischen und 15 min bei 25 ° C von Hand-und Abpipettieren. </li><li> Waschen Sie den aktivierten Beads 2 bis 3 mal in 0,5 bis 1,0 ml PBS, Zentrifugation bei 20.000 g für 3 Minuten bei 25 ° C nach jeder Wäsche. </li><li> Resuspendieren aktivierten Beads in 50 ul PBS. </li><li> Dann werden 50 ul der IP mAb (at 0,2-1,0 mg / mL Lager-Konzentration) an die aktivierten Bead-Lösung. </li><li> Mix für 3 bis 4 Stunden bei 25 ° C, indem man das Rohr auf einer vibrierenden Schüttler. Schütteln Sie genug, um zu verhindern Absetzen der Perlen auf dem Boden des Röhrchens. </li><li> Wash mAb-gekoppelten Kügelchen von 2 bis 3 mal in 0,5 bis 1,0 ml PBS, Zentrifugation bei 20.000 g für 3 Minuten bei 25 ° C nach jeder Wäsche. </li><li> Resuspendieren der Beads in 100 ul QBS Buffer. Diese können bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Aussetzung der Kügelchen gut, verdünnte 1:200-1:10,000 in PBS und zählen mit einem Hämacytometer. Die Konzentration muss für jeden präparativen Batch gemessen werden, so dass die Anzahl der Kugeln in jede IP-oder Pull-Down-Experiment verwendet genau gesteuert werden kann. </li></ol> 2. Post-nukleare Lysate Vorbereitung und Ip Die Lyse-Verfahren und optimale Lysebedingungen wird nach Zelltyp und Protein-Protein-Interaktionen untersucht abhängen. Eine Reihe von Protokollen vorhanden und können für Ihre Anwendung geändert werden. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 "kleine" Zellen, wie Lymphozyten oder 5 x 10 6 "große" Zellen, wie Makrophagen oder Tumorzellen, in 100 ul frisch Lysepuffer in einem 1,5-ml Mikrozentrifugenröhrchen für 20min auf Eis. Skalieren Sie die Lyse Volumen je nach Bedarf. </li><li> Zum Entfernen Kerne und unlöslichen Zelltrümmer, Zentrifuge das Lysat bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Add 0,5 x 10 5 bis 2,5 x 10 5 mAb-gekoppelten Kügelchen, um das geklärte Lysat, Pipettieren vorsichtig mischen. Das Mindestvolumen wir nutzen, umSie eine einzelne IP ist 5 ul. </li><li> Legen Sie auf einer vertikalen rotierenden Rad 4 Stunden bis über Nacht in einem kalten Raum. Set, um eine ausreichende Geschwindigkeit, um die Perlen Absetzen zu verhindern. Es ist akzeptabel für die Flüssigkeit der Low-Volume-IPs in den Boden des Röhrchens während der Rotation bleiben. </li></ol> 3. Probing der Bead-Capture-Protein mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern <ol><li> Waschen Sie die IP-Perlen zweimal in 0,2 bis 1,0 ml eiskaltem FCM-Puffer, Zentrifugieren bei 20.000 g bei 4 ° C für 3 min nach jeder Wäsche. </li><li> Resuspendieren der Beads in 100 ul FCM-Puffer und 20 ul Aliquot in jedem der fünf oder mehr 1,5-ml-Reaktionsgefäße oder Vertiefungen einer Kamin-Bodenplatte. </li><li> Add Fluorochrom-konjugierten mAbs zu den Proben. Führen Sie die FCM nach der Anweisungen des Herstellers oder nach empirisch ermittelten Konzentrationen Fleck. Als Ausgangspunkt, fügen Sie 0,2 bis 1 ul der Lager-Antikörper-Lösung (bei 0,2-1,0 mg / ml) pro Röhrchen oder gut, und Inkubation für 40 min auf Eis. </li><li> Wash sondiert Perlen in 1,5-ml-Röhrchen zweimal in 1,0 ml eiskaltem FCM-Puffer, Zentrifugieren bei 20.000 g bei 4 ° C für 3 min nach jeder Wäsche. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand nach jeder Wäsche, kümmert sich nicht um die Perlen zu stören. Für einen Kamin-Bodenplatte, waschen zweimal mit 0,2 ml eiskaltem FCM-Puffer, Zentrifugation bei 1000g für 5 min bei 4 ° C nach jeder Wäsche. Ein Mehrkanalpipette ist nützlich für diesen Schritt. Zum Entfernen von Perlen in einem Kamin-Bodenplatte Überstand, "Flick" die Platte einmal, dann, während noch upside-down, blot keine tropft von den Rändern der Vertiefungen. Das Restvolumen in jede Vertiefung, die die Perlen, etwa 20 ul werden. </li><li> Resuspendieren der Beads in 200 ul FCM-Puffer pro Probe. Transfer zum gekennzeichnet FACS-Röhrchen. Die Proben sind nun bereit für FCM. </li></ol> 4. FCM Acquisition Die CML Perlen in diesem Protokoll beschrieben werden 3 bis 5 um im Durchmesser, etwa die Hälfte des Durchmessers eines ruhenden Maus-Lymphozyten. Daher kann es notwendig sein, manuell erhöhen die Forward Scatter (FSC) amp zu gewinnen und den Side Scatter (SSC) Spannung, um für die Bevölkerung der Raupe Ereignisse auf der Skala zu registrieren. Einzelne IP-Perlen sollten eine einzige dicht gruppierten Bevölkerung. Die Einstellungen und Tor sollte so eingestellt werden bead Dubletten und Schmutz auszuschließen. <ol><li> Vor dem Ausführen von Perlen oder Kügelchen Standards, entfernen Sie die Tropfen Containment-Hülle, die den Probeneingang umgibt auf einigen Zytometern. Lassen Sie den Mantel Flüssigkeit zwischen den Proben tropfen, da dies den Einlass klar werden und verhindern, dass Perlen aus wurden auf das von einer Probe zur anderen. </li><li> Verwenden Sie unmarkiertem Perlen, eine negative Kontrolle der Fluoreszenz, und Rainbow Calibration Partikel (RCPs), eine positive Kontrolle der Fluoreszenz, um die Einstellungen so anpassen, dass sowohl die negativen und positiven Fluoreszenz Extremen gleichzeitig auf dem log-Skala x-Achse. Dies gewährleistet, dass die Fluoreszenz der experimentellen Proben werden auch auf-Skala. Beachten Sie, dass RCPs kleiner als die CML Perlen sind, so FSC-und SSC-Parameter sowie Schieberstellung, müssen eventuell vorübergehend für diese Probe verändert werden. </li><li> Zurück zu unmarkiertem-Bead-Einstellungen einmal Kalibrierung mit RCPs abgeschlossen ist. Wenn nur eine fluoreszierende Sonde pro Probe verwendet wird, ist keine Fluoreszenz Kompensation notwendig. Im Allgemeinen Sonde wir Multiproteinkomplexen mit einem Fluorochrom-konjugierten mAb pro FCM Probe, und wir untersuchen vielfachen Wechselwirkungen Partner durch Färbung parallel Perle Proben mit mAk spezifisch für die verschiedenen Untereinheiten. </li><li> Erfassen und Speichern des Fluoreszenz-Dateien. Die Analyse kann dann unter Verwendung der Durchflusszytometrie Software wie CellQuest, FlowJo oder CFlow werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. IP-FCM für TCR/CD3 Multiproteinkomplex. T-Zellen aus der Maus-Stamm BALB / c wurden in 1% Digitonin lysiert und das Lysat wurde auf IP-FCM unterzogen Verwendung von Anti-CD3ε Perlen. Die erfassten Komplexe enthalten erhebliche Mengen an TCR-β (lila-Region) und Co-assoziierte CD3-ε (grün), aber nahe Hintergrundbelastung (definiert durch die irrelevant Immunglobulin-Sonde, pink trace) von anderen Proteinen, wie Thy1.2, CD45 oder H-2K (d) (braun, orange und blau Spuren bezeichnet). Siehe ähnliche bisher veröffentlichten Ergebnisse 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen ist äußerst relevant für die Analyse von vielen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Abstammung Reifung, Zellzyklus-Progression und Apoptose-Kaskaden. IP-FCM bietet eine schnelle, quantitative und sensible Art der Wechselwirkung von Proteinen zu untersuchen und zu definieren Mitglieder Multiproteinkomplexen in nativer Konformation. Beads gekoppelt und inkubiert mit Zelllysaten in einem Tag und überprüft werden kann und analysiert den nächsten Tag. Ein 96-Well-Platte Format ermöglicht einer großen Anzahl von Proben, die gleichzeitig eine effiziente Datenerfassung für statistische oder Screening-Zwecke bieten analysiert werden. Unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen Standards, kann die Anzahl der Proteine, die durch jede Perle eingefangen geschätzt werden. Sehr wenig Ausgangsmaterial für die Erfassung und Erkennung benötigt wird, so beschränkt Proben und knappen Analyten kann noch für mehrere Interaktionen analysiert werden. Obwohl IP-FCM nicht erforderlich ist Gentechnik, Epitop-Tagging, Denaturierung oder in-vitro Mischen von Proteinen in einer nicht-physiologischen Umgebung, kann es mit diesen und anderen Techniken gekoppelt werden, wodurch es zu einem wertvollen und zugänglichen Tool mit Anwendbarkeit auf vielen biologischen Systemen. Fehlerbehebung: Viele IP-FCM Experimente erzeugen nützliche Protein-Interaktion Daten sie das erste Mal versucht werden. Allerdings kann die Optimierung von IP-FCM Antikörperkonjugation zu Perlen, Protein-Komplex zu erfassen, und fluoreszierende Sonde verbindlich zu verbessern. Die Effizienz von IP Antikörperkonjugation kann durch Sondieren gekoppelt Perlen direkt mit einem anti-Immunglobulin-Antikörper bestimmt werden. Wenn dies die Effizienz gering ist, kann die Erhöhung der Konzentration von Antikörpern während der Kupplung ermöglicht mehrere IP-Antikörper an jeder Perle befestigen. Dies kann die Bindungskapazität der IP bead Charge, was zu einer erhöhten Aufnahme und Detektion von Analyten. Andere primäre-Amin-haltigen Molekülen (z. B. Tris, Rinderserumalbumin) sollte nicht während der Kupplung vorhanden ist, da diese mit dem mAb für bead Befestigung und führen zu niedrigen mAb Kopplung konkurrieren. Wenn die Konjugation von mAb an Perlen als problematisch erweist aus anderen Gründen, können Perlen statt an Avidin / Streptavidin gekoppelt werden, und biotinylierte Antikörper kann anschließend nicht-kovalent gebunden und für die Immunpräzipitation. Trotz guter Antikörperkonjugation kann anfänglichen Erkennung von bead-assoziierten Fluoreszenz gering sein. Zunächst komplexen Erfassung selbst kann niedrig sein. Da IP-FCM hängt von der Konzentration von Analyten, die Erhöhung der Anzahl der Zellen pro Lyse Volumen lysiert erhöhen Analyt-Abscheidung und-Erkennung. Darüber hinaus kann Gefangennahme durch die Verringerung der Anzahl der IP-Kügelchen, die mit dem Lysat, die gefangen genommen Komplexe in weniger Perlen und führt zu einer erhöhten durchschnittlichen Fluoreszenz pro Bead wenn sondiert vertreibt inkubiert verbessert werden. Zweitens ist es möglich, dass der Zugang der Sonde Antikörper, um das aufgenommene Komplexe sterisch durch die immunoprecipitating Antikörper behindert. In diesem Fall kann das Problem durch den Einsatz verschiedener Antikörper und / oder die Sonde erfassen angesprochen werden.

<table><tbody><tr><td>Carboxylat-modifizierte Polystyrol-Latex (CML)-Kügelchen (5 mm, tensidfrei)</td><td>Reagenz</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Aufbewahrung bei 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Rainbow-Kalibrierpartikel</td><td>Reagenz</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Aufbewahrung bei 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl (EDAC)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Aufbewahrung bei -20&amp;#x00B0;C unter trockenen Bedingungen.</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail für den Allgemeingebrauch, enthaltend AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64 und Leupeptin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>100x-Stammlösung in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O herstellen. Aliquotieren und bei -20&amp;#x00B0;C lagern. Mit Handschuhen handhaben.</td></tr><tr><td>PCR-Platten, 96-Loch, 0,2 mL, naturfarben, hohe Wände</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>Verwendung anstelle von Mikrozentrifugenröhrchen während der FCM-Färbung</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: immunpräzipitation mittels durchflusszytometrie detected

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie (IP-FCM) erkannt ist eine effiziente Methode zur Detektion und Quantifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Das Grundprinzip erstreckt, dass der Sandwich-ELISA, wobei die erfassten primären Analyten zusammen mit anderen Molekülen physisch innerhalb Multiproteinkomplexen verbunden erkannt werden. Das Verfahren beinhaltet die kovalente Kopplung von Polystyrol-Latex-Mikroperlen mit immunoprecipitating monoklonale Antikörper (mAb) spezifisch für ein Protein von Interesse, Inkubation diese Perlen mit Zelllysaten, Sondieren erfasst Protein-Komplexen mit Fluorochrom-konjugierten Sonden und Analyse bead-assoziierten Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie. IP-FCM ist extrem empfindlich, ermöglicht die Analyse der Proteine ​​in ihrer nativen (nicht-denaturierten) Zustand, und ist zugänglich entweder semi-quantitative oder quantitative Analyse. Als weitere Vorteile, erfordert IP-FCM keine Gentechnik oder spezielle Ausrüstung, außer einem Durchflusszytometer, und es kann ohne weiteres für High-Throughput-Anwendungen angepasst werden.

Die IP-FCM-Methode vorgestellt, die eine sensible, robust, biochemische Beurteilung der nativen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichproben.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Die durch Durchflusszytometrie nachgewiesene Immunpräzipitation (IP-FCM) ist eine effiziente Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Die grundlegenden ...

Bei den IP-FCM-Experimenten werden Protein-Komplexe auf Kügelchen erfasst, um die miteinander wechselwirkenden verschiedenen Proteine zu identifizieren und zu untersuchen. Zunächst wird ein immunpräzipitierender Antikörper, der spezifisch für das Protein von Interesse ist, kovalent an Polystyrol-Latex-Kügelchen gekoppelt. In einem zweiten Schritt werden diese Kügelchen mit Zelllysaten inkubiert, wodurch das spezifische Protein und die damit wechselwirkenden Proteine an die Kügelchen binden können.Die Kügelchen zusammen mit den gebundenen Proteinen werden anschließend gewaschen und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die spezifisch für verschiedene Moleküle sind, die möglicherweise mit dem immunpräzipitierten Protein assoziiert sind, inkubiert. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Kügelchen mittels Durchflusszytometrie analysiert, um festzustellen, welche Proteine in den gebundenen Komplexen vorhanden oder abwesend sind. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie beispielsweise der Immunpräzipitation gefolgt von Western Blotting, liegt in der Fähigkeit der I-P-F-C-M, native Protein-Protein-Interaktionen zu bewerten, ohne genetische Modifikationen oder große Probenmengen zu erfordern.I-P-F-C-M kann ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis liefern, selbst wenn nur sehr wenig Biomaterial für die Analyse zur Verfügung steht, da es mit geringen Volumina und niedrigen Konzentrationen von Analyten durchgeführt werden kann. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die folgenden Puffer herstellen: MES-Kopplungspuffer, Puffer zum Abbrechen der Reaktion, Blockier- und Lagerpuffer (abgekürzt QBS) sowie Durchflusszytometrie- oder FCM-Puffer. Bestimmen Sie die Konzentration der carboxylatmodifizierten Polystyrol-Latex-Perlen oder CML-Perlen, indem Sie diese in PBS verdünnen und mit einem Hämozytometer zählen.Nachdem die Konzentration der Kügelchen bestimmt wurde, pipettieren Sie 18 mal 10 hoch sechs Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Kügelchen zwei bis drei Mal mit 0,5 bis einem Milliliter MES-Kopplungspuffer, wobei Sie bei Raumtemperatur dreimal für drei Minuten mit 20.000 × g zentrifugieren. Nach jeder Waschung, während die Kügelchen zentrifugiert werden.Bereiten Sie frischen MES-Puffer für die Aktivierung der Kügelchen vor. Sobald die Waschschritte abgeschlossen sind, bewahren Sie den Puffer entweder bei Raumtemperatur oder auf Eis auf. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikroliter MES-Kopplungspuffer.Fügen Sie dann 20 Mikroliter EEC MES zur Beadsuspension hinzu. Um die Carboxylgruppen auf den Beads zu aktivieren, mischen Sie vorsichtig bei Raumtemperatur, indem Sie kontinuierlich 15 Minuten lang per Hand auf- und abpipettieren. Obwohl dieser Schritt arbeitsintensiv ist, liefert diese Mischmethode nach dem Mischen die besten Ergebnisse.Die aktivierten Kügelchen zwei bis drei Mal in 0,5 bis einem Milliliter PBS-Centrifusion bei 20.000 × Schwerkraft drei Minuten bei Raumtemperatur waschen. Nach jeder Wäsche und nach der Endwäschung die aktivierten Kügelchen in 50 Mikrolitern PBS resuspendieren, um den IP-Antikörper an die Kügelchen zu koppeln. 50 Mikroliter des IP-Monoklonalen Antikörpers aus einer Stammlösung mit einer Konzentration zwischen 0,2 und einem Milligramm pro Milliliter hinzufügen.Stellen Sie sicher, dass keine Moleküle mit primären Aminen außer dem Antikörper vorhanden sind. Solche Amin enthaltenden Moleküle wie Tris oder Rinderserumalbumin konkurrieren mit dem Antikörper um die Kopplung an die Kügelchen. Mischen Sie die Suspension aus Kügelchen und Antikörper drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur auf einem vibrierenden Schüttler. Schütteln Sie ausreichend, um ein Absetzen der Perlen am Boden des Reaktionsgefäßes zu verhindern. Nach der Bindung die Antikörper-gebundenen Perlen zwei- bis dreimal mit 0,5 bis einem Milliliter PBS waschen, dabei bei 20.000 × g zentrifugieren.Zentrifugieren bei Raumtemperatur für drei Minuten nach jeder Wäsche. Schließlich die Kügelchen in 100 Mikroliter QBS-Puffer resuspendieren. Die Kopplung von monoklonalen Antikörpern an CML-Kügelchen kann durch Färbung der Kügelchen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen IgG überprüft werden.Nach der FCM-Analyse können die mit dem monoklonalen Antikörper beschichteten Kügelchen bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie für ein IP-Experiment verwendet werden. Zunächst müssen die Kügelchen gut resuspendiert und im Verhältnis von 1 zu 200 bis 1 zu 10.000 in PBS verdünnt werden, anschließend mit einem Hämozytometer gezählt werden. Die Konzentration muss für jede hergestellte Charge gemessen werden, damit die Anzahl der in jedem IP-Experiment verwendeten Kügelchen genau kontrolliert werden kann.Bereiten Sie anschließend eine frische Verdauungslösung in Wasser mit 2 % Gewicht pro Volumen vor. Erhitzen Sie sie fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Danach auf Eis abkühlen lassen.Verdünnen Sie das Material und geben Sie es in eine frisch zubereitete Lysepufferlösung mit einem Gehalt von 1 % (Gewicht pro Volumen) ein, und bewahren Sie es auf Eis auf. Bestimmen Sie die Anzahl der zu lysierenden Zellen anhand der angegebenen Tabelle als Richtwert. Die erforderliche Zellanzahl hängt jedoch vom jeweiligen Protein ab und muss empirisch ermittelt werden.Hier werden 30 Millionen Zellen aus einer kleinen lymphozytären Tumorzelllinie verwendet. Überführen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen bei 20.000 × g.Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius und aspirationieren Sie das Medium. Geben Sie die geeignete Menge frisch zubereiteter Dig-Lysepuffer zum Pellet und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.Anschießend die Zellen 20 Minuten lang auf Eis inkubieren lassen. Beachten Sie, dass die Zelllysebedingungen je nach Zelltyp und den untersuchten Protein-Protein-Interaktionen variieren können und empirisch bestimmt werden müssen, sobald die Lyse abgeschlossen ist. Entfernen Sie die Zellkerne und unlöslichen zellulären Bestandteile, indem Sie das Lysat bei 20.000 ×g zentrifugieren.Zentrifugieren Sie aufgrund der Schwerkraft 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die Überstände (SNA) und verwerfen Sie den Pellet, um das Zielprotein an die mit Antikörper beschichteten Perlen zu binden. Geben Sie 50.000 bis 250.000 monoklonale Antikörper-gekoppelte Perlen unter vorsichtigem Pipettieren zum geklärten Lysat hinzu.Die minimale Menge an Lysat, die für eine einzelne Immunpräzipitation verwendet wird, beträgt fünf Mikroliter. Geben Sie das geklärte Lysat und die Bead-Mischung auf ein rotierendes Vertikalrad und lassen Sie sie vier Stunden bis über Nacht in einem Kühlschrank bei einer ausreichenden Drehgeschwindigkeit inkubieren, um ein Absinken der Beads unter das Volumen der IPs zu verhindern; die Flüssigkeit kann während der Rotation am unteren Ende des Röhrchens verbleiben. Dies erfolgt nach der Bindung des Zielproteins an den IP-Antikörper.Fahren Sie fort mit der fluoreszenzmarkierten Markierung des Immunkomplexes. Waschen Sie die IP-Perlen zweimal in je einem Milliliter eiskaltem FCM-Puffer, indem Sie bei 20.000 × g für drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach jeder Waschung resuspendieren Sie die Perlen in 100 Mikrolitern FCM-Puffer und aliquotieren 20 Mikroliter in jeweils fünf oder mehr Proben.1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen oder Vertiefungen einer Platte mit Schornierboden. Beides ist hier dargestellt. Geben Sie fluorochrommarkierte monoklonale Antikörper zu den Proben hinzu.Führen Sie die FCM-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers oder anhand empirisch bestimmter Konzentrationen als Ausgangspunkt durch. Geben Sie 0,2 bis ein Mikroliter der Antikörper-Stammlösung mit mindestens 0,1 Milligramm pro Milliliter pro Röhrchen oder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 40 Minuten auf Eis. Waschen Sie die beladenen Kügelchen in 1,5-Milliliter-Röhrchen zweimal mit je einem Milliliter eiskaltem Puffer.Puffer für FCM, Zentrifugieren bei 20.000 × g bei vier Grad Celsius für drei Minuten. Nach jeder Wäsche vorsichtig den Überstand entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, die Perlen nicht aufzuwirbeln.Alternativ für einen Chimney-Boden: zweimaliges Waschen mit je 0,2 Milliliter eiskaltem FCM-Puffer durch Zentrifugation bei 1000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach jedem Waschschritt das Überstand entfernen, indem die Platte einmal vorsichtig geschüttelt wird; anschließend, während sie weiterhin verkehrt herum steht, eventuelle Tropfen an den Rändern der Vertiefungen abtupfen.Das Restvolumen in jedem Brunnen mit den Kügelchen beträgt etwa 20 Mikroliter. Suspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern FCM-Puffer pro Probe und überführen Sie sie in beschriftete FACS-Röhrchen. Die Proben sind nun bereit für die Durchflusszytometrie oder FCM an Becton Dickinson- und anderen Durchflusszytometern.Entfernen Sie die Tropfen-Auffanghülle, die das Probeninlet oder den Sipper umgeben kann. Lassen Sie den Sipper zwischen den Proben abtropfen, da dies verhindert, dass Kügelchen von einer Probe in die nächste übertragen werden. Die hier verwendeten CML-Kügelchen haben einen Durchmesser von drei bis fünf Mikrometern, etwa die Hälfte des Durchmessers eines ruhenden murinen Lymphozyten.Daher kann es erforderlich sein, die Verstärkung des Forward-Scatter-Amps und die Spannung des Side Scatter manuell zu erhöhen, damit die Population der Bead-Ereignisse am Durchflusszytometer registriert wird. Hierzu werden unmarkierte oder leere Beads verwendet. Die Einstellungen in GAIT werden angepasst, um Beads, Doubletts und Abri vor der Messung auszuschließen.Experimentelle Proben gewährleisten, dass die Fluoreszenz im Messbereich liegt. Die unmarkierten Kügelchen dienen als negativer Fluoreszenzkontrollwert, und Regenbogen-Kalibrierpartikel oder RCPs können als positiver Fluoreszenzkontrollwert verwendet werden. Da die RCPs kleiner sind als die CML-Kügelchen, müssen möglicherweise die Parameter Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung sowie die Gating-Position vorübergehend für diese Probe angepasst werden.Nach diesen Kalibrierungen werden die negativen und positiven Fluoreszenzextreme auf einer logarithmischen Achse dargestellt. Sobald die Kalibrierung mit RCPs abgeschlossen ist, kehren Sie zu den Einstellungen für unmarkierte Kügelchen für Vorwärts- und Seitenstreuung zurück. Solange pro Probe nur eine fluoreszierende Sonde verwendet wird, wie im hier gezeigten Experiment, ist keine Fluoreszenzkompensation erforderlich.Jetzt werden die Fluoreszenzdatendateien erfasst und gespeichert; die Analyse erfolgt anschließend mit Hilfe von Durchflusszytometrie-Software wie Cell Quest oder FlowJo. Hier sehen Sie das Ergebnis einer IP-FCM-Analyse von Maus-T-Zellen LY in 1 % Digitonin. Der TCR-CD3-Proteinkomplex wurde mit Anti-CD3ε-Kügelchen angereichert.Die isolierten Komplexe enthalten signifikante Mengen an TCR-Beta und assoziiertem CD3-Epsilon. Nahezu Hintergrundwerte anderer Proteine wurden nachgewiesen, wie durch die Verwendung einer irrelevante Immunglobulin-Sonde oder Antikörper gegen die Proteine TH1.2, CD45 oder H-2Kd bestimmt wurde. Die Vorteile dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Immunpräzipitation gefolgt von Western Blotting bestehen darin, dass mittels I-P-F-C-M native Protein-Protein-Interaktionen ohne Notwendigkeit genetischer Modifikation oder großer Probenmengen untersucht werden können. I-P-F-C-M kann selbst bei sehr geringen verfügbaren Biomaterialmengen hohe Signal-Rausch-Verhältnisse liefern, da die Methode mit geringen Volumina und niedrigen Analytkonzentrationen durchgeführt werden kann.

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Biologie

In diesem Video demonstrieren wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik zur Bestimmung des Anteils von Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen, CIK-Zellen, die aus einer mononukleären Zellkultur aus dem peripheren Blut expandiert wurden.

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Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

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Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.

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Entzündung spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass es wie ein zweischneidiges Schwert wirkt, das frühe Hirnverletzungen verschlimmert, aber auch zur späteren Reparatur beiträgt. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn und ihre anschließende durchflusszytometrische Phänotypisierung.

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Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören

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Durchflusszytometrie Imaging bietet einen idealen Ansatz um die morphologische und funktionelle Veränderung der Zellen auf individuelle und populational Ebene zu erkennen. Gestörten endocytic Funktion für Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-exponierten menschlichen dendritischen Zellen wurde mit einem kombinierten transkriptomischen Profilierung der Genexpression und morphologischen Demonstration des Handels mit Protein nachgewiesen.

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Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

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Identifizierung von Mikroglia und peripher infiltrierenden Makrophagen im verletzten Rückenmark mittels Durchflusszytometrie

Lernen Sie die IP-FCM-Methode zur Analyse nativer Protein-Protein-Interaktionen mittels Immunpräzipitation und Durchflusszytometrie. Diese Technik ermöglicht hochsensitive Detektion ohne genetische Modifikation.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

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