Name: Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Erfahren Sie die doppelte Immunhistochemie-Labeling-Methode für Kaposi-Sarkom-Gewebe zur gleichzeitigen Visualisierung viraler und zellulärer Proteine. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung dysregulierter Wirtszellfaktoren durch KSHV-Infektion.

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Wir danken James EK Hildreth, Meharry Medical College, für seine Beratung und Überprüfung des Manuskripts. Wir danken auch Diana Marver für die Bearbeitung des Manuskripts. Zentrum für AIDS Gesundheit Disparitäten Forschung, NIH 5U54 RR019192-05;; die Meharry Zentrum für Klinische Forschung, NIH Grant P20RR011792; Diese Arbeit wurde von der Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05) unterstützt und von NIH gewähren P01 CA113239. DJA wurde teilweise durch Piloten Zuschüsse aus dem Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) und die Meharry Zentrum für Klinische Forschung (CRC) finanziert.

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

Die Methoden in diesem Bericht verwendet werden kann in einer Vielzahl von Labor-Einstellungen vorgenommen werden. Sie erfordern eine spezielle Ausrüstung oder den Zugang zu zentralen Einrichtungen. Die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wenn dabei Experimente mit infektiösen viralen Krankheitserreger wie KSHV, die den Einsatz einer mit Gentechnik-Stufe 3 (BSL-3) Einrichtungen erfordern kann. Tissue Akquisitionen müssen auch von den entsprechenden Institutional Review Boards (Ethikkommissionen) genehmigt werd...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2-Medien</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ Ergänzung mit Bullet-Kits</td></tr><tr><td>DMVEC-Zellen (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Fetalkalbserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kammerobjektträger</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>KSHV-LANA-Mab</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50 Verdünnung/IFA</td></tr><tr><td>Galectin-3 Ziegen-pAb</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Ziege FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Ziege Rho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100 Verdünnung/IFA</td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield mit DAPI</td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Ziege-konjugiert</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Western-Substrat</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-Kaninchen-anti-Ziege</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>AP-Streptavidin-Konjugat</td><td>Dako</td><td>K 0492 (Kit)</td><td></td></tr><tr><td>DNase-freies RNase-Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Photometer</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>RC 6 Plus Zentrifuge</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Optima L-90K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>MYiQ iCycler Echtzeit-PCR-Detektionssystem</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>TE 2000S Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizieren dysregulated gene von kaposi-sarkom-assoziierten herpesvirus (kshv) induced

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Derzeit KS ist die vorherrschende HIV / AIDS-Malignome im südlichen Afrika und damit die Welt. 1,2 Es wird als angioproliferative Tumor des vaskulären endothelialen Zellen charakterisiert und produziert seltenen B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen in Form von Pleuraerguss Lymphome (PEL) und einige Formen der multizentrischen Castleman-Krankheit. 3-5 Nur 1-5% der Zellen in KS-Läsionen aktiv unterstützen lytischen Replikation des Kaposi-Sarkoms-assoziierten Herpesvirus (KSHV), die als Erreger mit KS verbunden, und es ist klar, dass zelluläre Faktoren müssen Interaktion mit viralen Faktoren in den Prozess der Onkogenese und Tumorprogression. 6,7 Identifizierung neuartiger Host-Faktor Determinanten, die KS Pathologie beitragen wird für die Entwicklung prognostischer Marker für Tumorprogression und Metastasierung sowie bei der Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von KS wesentliche . 8 Das dazugehörige Video Details der Methoden, die wir verwenden, um Wirtszelle Genexpression Programme in dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (DMVEC) nach KSHV Infektion und in KS Tumorgewebe verändert zu identifizieren. 9 Sobald dysregulierten Gene durch Microarray-Analyse identifiziert werden, sind Veränderungen in der Proteinexpression bestätigt durch Immunoblot-und Dual gekennzeichnet Immunfluoreszenz. Änderungen in transkriptionelle Expression von dysregulierten Gene sind in vitro durch quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bestätigt. Validierung von in vitro-Ergebnisse mit Hilfe von Archivierungs KS Tumorgewebe wird auch durch dual bezeichnet Immunchemie und Tissue Microarrays durchgeführt. 8,10 Unser Ansatz zur Identifizierung dysregulierten Gene in den KS Tumorgewebe Mikroumgebung ermöglichen die Entwicklung von in vitro und anschließend in vivo-Modell für Entdeckung und Bewertung potenzieller neuer therapeutischer für die Behandlung von KS.

Wirtszelle Faktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Errichtung und Wartung von Kaposi-Sarkom (KS). Wir skizzieren Methoden zur Wirtszelle Faktoren in KSHV-infizierten DMVEC Zellen verändert zu identifizieren und in KS Tumorgewebe. Zellulären Genen durch Viren verändert wird als potenzielles Ziel (e) für neuartige Therapeutika dienen.

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

Derzeit ist das Kaposi-Sarkom (KS) die am häufigsten auftretende HIV/AIDS-assoziierte Malignität in Subsahara-Afrika und damit weltweit.1,2 Es ist als eine angioproliferative ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Doppelfärbung von Kaposi-Sarkom-Tumorgewebe mittels Immunhistochemie für virale und Wirtszellproteine zu demonstrieren. Dies wird zunächst durch Antigenfreisetzung mittels Hitze erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Applikation eines mit Biotin konjugierten primären Antikörpers.Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Zugabe des Strep-Din-Enzym-Konjugats. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Zugabe des Enzymsubstrats zum Gewebe zur Farbentwicklung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Lokalisation sowohl viraler als auch Wirtszellproteine im Tumorgewebe mittels immunhistochemischer Färbung zeigen.Diese Methode kann wichtige Fragen auf dem Gebiet der Pathologie beantworten, beispielsweise die Identifizierung infektiöser Erreger sowie dysregulierter zellulärer Gene in derselben Probe. Unter einem Abzug setzen Sie bis zu acht ChemEight-Objektträger mit fünf Mikrometer dicken Schnitten von fixiertem, paraffineingebettetem Gewebe in ein Coplin-Gefäß mit Xylol. Inkubieren Sie für 10 Minuten, um das Paraffin zu entfernen und die Objektträger für eine doppelt markierte Immunhistochemie vorzuberei

identifying-dysregulated-genes-induced-kaposi-s-sarcoma-associated

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Verfahren zur Beobachtung der einzelnen DNA-Molekülen in lebende Zellen beschrieben. Die Technik basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Proteins an lac-Repressor-Bindungsstellen in die DNA von Interesse entwickelt basiert. Dieses Verfahren kann gut auf rekombinanten DNAs in lebende Zellen im Laufe der Zeit zu folgen.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Wir beschreiben ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit einem Modell-Herpesvirus, murinen Gammaherpesvirus-68 (γ HV68) infiziert, die für die menschliche Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) eng verwandt ist, zu messen. Mit Hilfe genetisch veränderter Mausstämme und embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), untersuchten wir die antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo. "Reconstituting" den Ausdruck der angeborenen...

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro System zur Modellierung der de novo lytischen Infektion des Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus unter Verwendung von BAC16-abgeleiteten Virionen. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der frühen Virusreplikation und -verbreitung. Die Produktion infektiöser Viren wird durch GFP-basierte Assays für infektiöse Einheiten und Echtzeit-PCR von verkapselten Virusgenomen quantifiziert.

Etablierung und Quantifizierung der de novo lytischen Infektion durch zellfreies Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus

Erfahren Sie die doppelte Immunhistochemie-Labeling-Methode für Kaposi-Sarkom-Gewebe zur gleichzeitigen Visualisierung viraler und zellulärer Proteine. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung dysregulierter Wirtszellfaktoren durch KSHV-Infektion.

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

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