Name: In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Erfahren Sie ein optimiertes In-situ-Hybridisierungsprotokoll mit Ribosonden zur Analyse der Genexpression in Schmetterlingsflügeln von Bicyclus anynana während der Puppenstadien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche Technical Support, um Hilfe bei der Fehlersuche dieses Protokoll. Wir danken auch William Piel um Rat bei der Bearbeitung des Films.

TAG 1 <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> ddH 2 O <ul><li> Add DEPC für 0,1% Gesamtvolumen und schütteln kräftig Lösungen. </li><li> Autoclave. </li></ul></li><li> 4% Paraformaldehyd Fix - mit PBS-DEPC </li><li> Proteinase K-Lösung - wenn Niederschlag vorhanden ist, Vortex kräftig, bevor Sie aliquoten </li><li> Verdauung Anschlagpuffer </li><li> Prähybridisierungspuffer </li><li> 50:50 PBT: Prähybridisierungspuffer </li><li> Hybridisierungspuffer <ul><li> Lösungen sollten gehalten RNase-frei sein. Verwenden Sie entweder Glas-ware, die gebacken hat (4 Stunden bei 250 ° C) oder Einweg-Kunststoff. Serologische Pipetten sind sehr nützlich für die Herstellung von Lösungen </li></ul></li></ul></li><li> Dissect Flügel von Zeit inszenierte Puppen in PBS </li><li> Bewegen Flügel direkt auf Buffer in Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatte Fix bei Raumtemperatur </li><li> Fix-Discs für 2 Stunden </li><li> Wash 5 x 5 Minuten in PBT </li><li> Inkubieren Flügel für 3 Minuten in Proteinase K-Lösung </li><li> Spülen Sie 2 x in der Verdauung Anschlagpuffer </li><li> Wash 5 x 5 Minuten in PBT </li><li> Wash 2 x 5 Minuten in 50:50 PBT: PHB </li><li> Wash 1 x 10 Minuten in PHB </li><li> Inkubieren in PHB mindestens 1 Stunde bei 55 ° C. </li><li> Heat-denaturieren RNA-Sonde (20-50ng pro Well benötigt) (80 ° C für 5 Minuten) und fügen Sie Hybridisierungspuffer (100 ul pro Well benötigt) </li><li> Add-Sonde in die Vertiefungen und inkubieren 48 Stunden bei 55 ° C </li></ol> TAG 3 <ol><li> Wash 4 x 5 Minuten in 55 ° C PHB </li><li> Inkubieren über Nacht in PHB bei 55 ° C </li></ol> TAG 4 <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> Antikörper Blockpuffer </li></ul></li><li> Wash 1 x 5 Minuten in 50:50 PBT: PHB </li><li> Wash 4 x 5 Minuten in PBT </li><li> Inkubieren Flügeln für 1 Stunde in Blockpuffer bei 4 ° C </li><li> Inkubieren Flügel in einer 1:2000 Verdünnung von Anti-Dig-Antikörper über Nacht bei 4 ° C </li></ol> TAG 5 <ol><li> Bereiten Sie folgende Lösungen: <ul><li> Erkennung Buffer </li></ul><ul><li> Entwickeln Solution - lichtempfindlich (wrap in Folie) </li></ul></li><li> Wash 3 x 5 Minuten in PBT bei Raumtemperatur </li><li> Wash 7 x 5 Minuten in PBT </li><li> Spülen Flügel zwei Mal in Detektionspuffer </li><li> Develop Flügel in 1 ml der Entwicklung Solution - Zeit der Entwicklung muss jedes Mal kontrolliert werden - die Entwicklung von Zeiten können auch geändert werden, wenn die gleichen Sonden-und Entwicklungsländern Lösung - in der Regel nach 5-10 Minuten zu überprüfen und dann zu erhöhen Abständen bis zu übernachten. Platte sollte in Folie gewickelt werden, um Belichtung zu verhindern, wenn nicht die Überprüfung von Proben. </li><li> Spülen Sie fünf Mal in Entwicklungsländern Anschlagpuffer </li><li> Berg Flügel. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Optimierung bestehender Protokolle In situ Hybridisierungen auf Larven Flügel Scheiben erfolgreich durchgeführt wurden mit Scheiben aus Precis coenia Schmetterlinge (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. Das derzeitige Protokoll hat sich von einer ausführlichen schriftlichen Protokoll auf Anfrage von der Carroll Lab für die Larven Flügel Färbungen angepasst. Die Veränderungen, die wir gemacht dienen, um Unterschiede zwischen Larven-und Puppenstadium Flügel Gewebe aufnehmen. Während Puppenstadium Hinterflüge...

<table><tbody><tr><td>Fixierpuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>4% Paraformaldehyd in PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1% Tween 20 in PBS</td></tr><tr><td>Proteinase-K-Lösung</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml Proteinase K in PBT</td></tr><tr><td>Puffer zur Beendigung der Verdauung</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml Glycin in PBT</td></tr><tr><td>Vor-Hybridisierungspuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>Für 50 ml PHB: 12 ml DEPC-behandeltes Wasser + 25 ml Formamid + 12,5 ml 20 x SSC + 50 µl Tween 20 + 500 µl 10 mg/ml Lachssperma (RNase-frei, vor Zugabe zur Lösung hitzedenaturiert).</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>1 mg/ml Glycogen zum Vor-Hybridisierungspuffer hinzufügen</td></tr><tr><td>Blockpuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Alkalische Phosphatase-konjugiert</td></tr><tr><td>DIG-Wasch- und Blockierpuffer-Set</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount, wässriges Einbettmedium</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Einbettmedium</td></tr></tbody></table>

in situ-protokoll für butterfly puppenstadium flügel mit ribosonden

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Hier präsentieren wir Ihnen im Video-Format, ein Protokoll für in situ Hybridisierungen in Puppenstadium Flügel des Schmetterlings Bicyclus anynana mit Ribosonden. In situ Hybridisierungen, sind eine tragende Säule der Entwicklungsbiologie, nützlich, um die räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression in Geweben entwickeln auf der Ebene der Transkription zu studieren. Wenn Antikörper, die das Protein Produkte der Gen-Transkription Ziel noch nicht entwickelt worden, und / oder gibt es mehrere Genkopien eines bestimmten Proteins in das Genom, die nicht differenziert werden können mit den verfügbaren Antikörper ist, kann in situs verwendet werden. Während eine in-situ-Technik für die Larven Flügel-Discs verfügbar war, um den Schmetterling Gemeinde seit mehreren Jahren hat sich die aktuelle Protokoll für die größeren und fragile Puppenstadium Flügel optimiert.

Um die Genexpression in den Puppenstadium Flügel Gewebe Bicyclus anynana untersuchen, stellen wir ein optimiertes Protokoll für in situ Hybridisierungen mit Ribosonden. Wir bieten auch Richtlinien für die weitere Optimierung des Protokolls für den Einsatz in Puppenstadium Flügel der andere Lepidopteren Arten.

In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden

Hier präsentieren wir in Videoformat ein Protokoll für In-situ-Hybridisierungen in den Puppenflügeln des Schmetterlings Bicyclus anynana unter Verwendung von Riboproben. In situ ...

Dies ist ein Ceto-Protokoll für Schmetterlingsflügel im Pupillenstadium. Wir beginnen damit, Präpuppen aus dem Käfig zu sammeln, sie auf ein Tablett zu legen und anschließend ihre exakten PPU-Patientenzeiten mithilfe der Zeitrafferfotografie zu dokumentieren. Dies ermöglicht es uns, die Färbungen zu genau definierten Zeitpunkten nach der Verpuppung durchzuführen.Das ist wichtig, weil verschiedene mRNA-Moleküle für unterschiedliche Proteine zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Paarung exprimiert werden. Hier dissektieren wir die Pupillenflügel in einer Petrischale mit Silikonuntergrund, und der entscheidende Schritt besteht darin, die Flügel zu entfernen und sie in die Fixierungslösung zu geben, damit sie möglichst flach liegen. Wenn sie in diesem Stadium nicht flach sind, werden sie es später nie mehr werden.Nach der richtigen Fixierungszeit entfernen wir den fixierenden Puffer und waschen fünfmal. Der Proteinase-Kase-Schritt ist mit PBT eher kritisch und dient dazu, das Gewebe für die Sonde permeabil zu machen; er sollte zum richtigen Zeitpunkt durch diese Spülungen und Waschungen gestoppt werden. Der Lachssperma dient als kostengünstige DNA-Quelle, um zu verhindern, dass die Sonde überall bindet.Das Sperma ist eine der Komponenten des Prähybridisierungspuffers. Hier fügen wir also das Sperma dem Prähybridisierungspuffer hinzu, und anschließend wird eine Lösung hergestellt, nämlich die 1-50-50-P-B-T-P-H-B-Hälfte, bestehend aus je einer Hälfte PBT und Prähybridisierungspuffer. Diese Lösung dient als Zwischenlösung, um die Flügel vorsichtig aus der PBT-Lösung, in der sie präpariert wurden, in die Prähybridisierungslösung zu überführen.Es gibt daher einen Zwischenschritt, bei dem die Flügel zunächst in dieser 50-50-Lösung liegen. Hier werden die Flügel 10 Minuten in PHP inkubiert und anschließend erneut eine Stunde bei 55 Grad in PHP. In der Zwischenzeit stellen wir den Hybridisierungspuffer her, der lediglich aus Prähybridisierungspuffer und Glykogen besteht.Hier fügen wir Glykogen zu PHV hinzu, um eine kleine Menge Hybridisierungspuffer herzustellen. Zu diesem Puffer werden wir die denaturierte Sonde hinzufügen. Dazu erwärmen wir einen Heizblock und zentrifugieren die Sonde, die bei minus 20 gelagert wurde, und überführen die richtige Menge an Sonde in ein Röhrchen, das für etwa fünf Minuten bei 80 Grad denaturiert wird. Hier denaturieren wir zwei Sonden gleichzeitig, fügen also Hybridisierungspuffer zur Sonde hinzu und geben anschließend hundert Mikroliter der Sondenmischung in jedes Reaktionsgefäß.Um diesen Schritt abzuschließen, bedecken wir alle Vertiefungen mit Perfil, da die Flügel für die nächsten zwei Tage bei 55 Grad inkubiert werden, und das Perfil verhindert eine Verdunstung. Nach zwei Tagen Inkubation wird die Sonde durch Waschen der Flügel mit PHP entfernt, wobei der letzte Waschschritt für weitere 12 bis 24 Stunden auf den Flügeln verbleibt. Abschließend werden die Flügel in einer Abfolge von Schritten gewaschen, um sie wieder in die PBT-Lösung zu überführen. Dabei wird erneut die 50-50-Mischlösung verwendet.In diesem Stadium wird die Antikörper-Blocklösung zu den Flügeln gegeben, und der mit alkalischer Phosphatase konjugierte Anti-Dig-Antikörper wird zu PBT hinzugefügt, um eine Konzentration von etwa 1 zu 2000 zu erreichen. Etwa 300 Mikroliter dieser Antikörperlösung werden zu jedem Well gegeben, und anschließend werden die Flügel über Nacht im Kühlschrank zur Inkubation mit dem Antikörper belassen. Am nächsten Tag wird der Antikörper durch mehrfaches Waschen mit PBT entfernt, und danach werden die Flügel zweimal bei Raumtemperatur mit der Detektionspufferlösung gespült.Schließlich wird ein Mill Entwicklerlösung zu jedem Well hinzugefügt und die Flügel schnell mit Aluminiumfolie abgedeckt. Nach etwa 10 Minuten überprüfen wir den Fortschritt, und die Flügel beginnen, lila zu erscheinen, sind aber noch etwas hell. Daher werden sie erneut abgedeckt, und einige Minuten später kontrollieren wir erneut, wobei sich zeigt, dass sie etwas dunkler geworden sind.Beachten Sie, dass Flügel, die in verschiedenen Proben inkubiert wurden, ihre jeweils leicht unterschiedlichen Dunkelungsraten aufwiesen, weshalb wir beschlossen, sie erneut abzudecken. Schließlich entschieden wir uns nach 20 Minuten, die Reaktion mit dem Entwicklungsstopp-Puffer zu beenden. Die Flügel sind nun bereit, auf einen Objektträger aufgebracht zu werden. Dazu geben wir einen kleinen Tropfen Einbettmedium auf einen beschrifteten Objektträger und übertragen die Flügel mithilfe einer Pinzette auf den Tropfen. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen, richten Sie den Flügel vorsichtig aus und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.In diesem Experiment verwenden wir die Sonde, die auf Transkripte des grail-Gens abzielt, und beobachten ihre Lokalisation im Zentrum des zukünftigen IPO-Musters des Schmetterlings durch Cyclist anana in den frühen Stadien der Pupillenflügelentwicklung.

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Der Xenopus laevis Embryo ist aufgrund seiner Größe und Leichtigkeit der Manipulation weiterhin außerordentlich nützlich bei der Erforschung der frühen Entwicklung.   Es wird ein vereinfachtes Protokoll für das Whole Mount in situ Hybridisierungsprotokoll zur Verfügung gestellt, das bei der Identifizierung spezifischer Organe in diesem Modellsystem verwendet werden kann.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet  Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Erfahren Sie ein optimiertes In-situ-Hybridisierungsprotokoll mit Ribosonden zur Analyse der Genexpression in Schmetterlingsflügeln von Bicyclus anynana während der Puppenstadien.

In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden

Weitere Videos entdecken