DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten
6. Juli 2010
Wir demonstrieren den Einsatz der Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DII, zu Neuronen in Hirnschnitten von Nagern und Primaten verschiedener Altersstufen einzuführen. In diesem speziellen Fall, verwenden wir erwachsenen Mäusen (3-6 Monate alt) und Erwachsenen cynomologus Affen (9-15 Jahre alt). Diese Technik, die ursprünglich von dem Labor von Dr. Lichtman beschrieben (Gan Et al., 2000), ist gut für die Untersuchung der dendritischen Verzweigungen und dendritischen Dorn Morphologie geeignet und lässt sich mit herkömmlichen Immunfärbung kombiniert werden, wenn Waschmittel bei einer geringen Konzentration gehalten werden.
Mein Name ist Gail Siebel und ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Veronica Alvarez am Nationalen Institut für Alkoholmissbrauch und Alkoholabhängigkeit. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Kathleen Grant und Andrew Wow vom Oregon Primate Center sowie Dr. James Dene von der Wake Forest University durchgeführt, die das für diese Studie verwendete Gewebe von nichtmenschlichen Primaten bereitstellten. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende Farbstoffe in Neuronen einzubringen und Gehirnschnitte aus verschiedenen Spezies wie Nagetieren und Primaten jeden Alters zu markieren.
Zum Studium der Morphologie von Dendriten und dendritischen Dornen erfolgt dies, indem zunächst Ts und Kügelchen mit einem lipophilen Farbstoff wie D eye beschichtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Schläuche mit D eye-beschichteten Kügelchen auszukleiden und in kleine Stücke zu schneiden, die als Geschosse für das Helios-Genkanonen-System dienen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die mit D eye beschichteten Kügelchen mithilfe der Genkanone in Gehirnschnitte abzuschießen.
Der letzte Schritt des Verfahrens ist optional, da die Stylistik mit Immunfärbungen kombiniert werden kann, um weitere Marker gleichzeitig zu lokalisieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine spärliche fluoreszierende Markierung von Neuronen zeigen, die für hochauflösende Bildgebung wie konfokale oder Zweiphotonenmikroskopie sowie für die Untersuchung der dendritischen Verzweigung und der Morphologie dendritischer Dornen geeignet ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden liegt darin, dass die Stylistik auf Gehirnschnitte von Tieren aller Arten, Altersstufen und Genotypen angewendet werden kann.
Es kann in Kombination mit Immunfärbungen verwendet werden und erzeugt eine spärliche fluoreszierende Markierung, die für die hochauflösende Mikroskopie geeignet ist. Bevor Sie die Projektile herstellen, beschichten Sie Wolframkugeln mit einem lipophilen Farbstoff in einem chemischen Abzug bei 450 Milliliter Methylenchlorid und 13,5 Milligramm lipophilem Farbstoff (Farbstoff „Dye Eye“) für eine Endkonzentration von 30 Milligramm pro Milliliter. Nehmen Sie ein vorbereitetes Eloqua-Röhrchen, das 300 Milligramm Wolframkugeln enthält, und geben Sie 300 Mikroliter Methylenchlorid hinzu. Pipettieren Sie die Mischung kräftig, um die Kugeln erneut in Suspension zu bringen und eine homogene Lösung zu erhalten.
Es werden nur 100 Milligramm Woltamperlen pro Kugelsatz verwendet. Pipettieren Sie auf und ab, um die Perlen resuspendiert zu halten, und geben Sie 100 Milliliter der Perlen und des gelösten Farbstoffs auf einen Objektträger, und vermischen Sie diese gründlich. Mit einer Pipettenspitze vollständig an der Luft trocknen lassen, bis die Perlen hellgrau werden. Legen Sie ein sauberes Stück gewachstes weißes Papier unter den Objektträger. Mit einer sauberen Rasierklinge werden für jede Farbe der Kugeln die Perlen vom Glas abgekratzt und zu einem feinen Pulver zermahlen.
Die beschichteten Kügelchen auf ein WHEY-Papier abkratzen und über einen Trichter in ein 15-Milliliter-Konischglas geben. Drei Milliliter Wasser hinzufügen und 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Wasserbad beschallen, um eventuelle Klumpen gründlich aufzulösen. 0,7 Meter türkisfarbene Schlauchleitung mit einem schrägen Schnitt an einem Ende abschneiden und das andere Ende mithilfe eines Schlauchadapters an eine 12-Milliliter-Spritze anschließen. Das freie Ende in ein Gefäß mit 10 Millilitern einer 10-Milligramm pro Milliliter-Polyvinylpernon- oder PVP-Lösung eintauchen lassen und die Lösung vollständig durch die Schlauchleitung in die Spritze ziehen.
Vortexen Sie die Perlenlösung, während Sie mit der Spritze pumpen, um schnell eine homogene Mischung herzustellen und die Ausfällung der Perlen zu vermeiden; ziehen Sie die Lösung vollständig in den Schlauch ein. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen, da diese verhindern, dass die Perlen an dieser Stelle am Schlauch haften, während Sie den Schlauch an beiden Enden straff halten. Kippen Sie ihn von Seite zu Seite, um eine gleichmäßige Verteilung zu erzielen.
Verteilen Sie die Kügelchen. Führen Sie den Schlauch in die Vorbereitungsstation ein und lassen Sie die Kügelchen 30 bis 60 Sekunden lang absetzen. Verwenden Sie die Spritze, um langsam, aber gleichmäßig zu arbeiten.
Entfernen Sie das Wasser, wobei die Kügelchen zurückbleiben. Trennen Sie sofort die Spritze ab und beginnen Sie, die Säule zu durchmischen. Stellen Sie den Stickstofffluss an der Aufreinigungsstation auf vier bis fünf LPM trocken für 10 bis 20 Minuten ein, bis keine Wassertröpfchen mehr sichtbar sind.
Entfernen Sie die Schläuche von der Vorbereitungsstation, schneiden Sie Geschosse mit dem Rohrschneider in 13 Millimeter lange Stücke, wobei an guten Geschossen ein schwacher grauer Schleier gleichmäßig die Innenseite bedecken wird. Legen Sie die Geschosse in mit Folie umwickelte Szintillationsgefäße, die ein Trockenmittel wie wasserfreies Calciumsulfat enthalten. Lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis sie zum Abschießen bereit sind.
Die Diic-Färbung kann verwendet werden, um Neuronen in Gehirngewebe verschiedener Arten und Altersstufen zu färben, die mit unterschiedlichen Methoden konserviert wurden. Legen Sie Schnitte von Gehirn, die entweder vor oder nach dem Schneiden fixiert wurden, in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte.
Waschen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, wobei jeder Waschschritt fünf bis zehn Minuten dauert. Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette und zentrieren Sie den Schnitt mithilfe eines Pinsels in der Vertiefung. Legen Sie ein Stück 3,0-Mikrometer-Filter zwischen die beiden metallenen Diffusionsgitter am Ende des Barrel-Liners der Genkanone.
Halten Sie die Genkanone so, dass das Ende des Lauffutters 1,5 Zentimeter vom Probematerial entfernt ist. Spritzen Sie die Kügelchen mit einem Heliumgasdruck von 120 bis 180 PSI in den Schnitt. Spülen Sie die Schnitte dreimal kurz mit einem XPBS, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen.
Stellen Sie sicher, dass die Schnittfläche des Schnitts während aller Flüssigkeitsmanipulationsschritte nach oben weist. Lagern Sie die Schnitte in PBS für drei bis sechs Stunden, um die Ausbreitung des DAI entlang der Dendriten zu ermöglichen; bedecken Sie sie mit Folie. Da DAI lichtempfindlich ist, können die Schnitte zu diesem Zeitpunkt montiert oder weiteren Antikörperfärbungen gemäß dem nächsten Abschnitt unterzogen werden, um mit 300 bis 500 Mikrolitern Permeabilisierungslösung, die 0,01 % TRITTON X 100 in 1× PBS enthält, pro Schnitt zu färben und genau 15 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren.
Entfernen Sie die Permeationslösung aus den Vertiefungen. Blockieren Sie die Schnitte in einer Lösung, die 10 % Ziegenserum und 0,01 % Triton X-100 in 1× PBS enthält, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie 300 bis 500 Mikroliter Primärantikörper, verdünnt in der Blockierungslösung, zu jedem Behältnis hinzu. Inkubieren Sie 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht, je nach Antikörper. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit 1× PBS, jeweils 5 bis 15 Minuten, und entfernen Sie anschließend die Lösung aus den Vertiefungen.
Geben Sie 300 bis 500 Mikroliter sekundären Antikörper, verdünnt in Blockierungslösung, zu jedem hinzu. Waschen Sie viermal mit 1× PBS, jeweils fünf bis 15 Minuten lang, wie zuvor. Bringen Sie die Schnitte mit einem fluoreszierenden Eindeckmedium auf einen Objektträger auf und decken Sie sie mit einem 18 mal 18 Millimeter großen Deckglas ab. Lassen Sie die Probe sechs bis 12 Stunden bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie die Ränder mit klarem Nagellack versiegeln und im Dunkeln oder abgedeckt bei vier Grad Celsius lagern.
Hier sind beispielhafte Bilder von markierten Gehirnschnitten dargestellt. Zwei wichtige Merkmale, auf die zu achten ist, sind ein spärliches Markierungsmuster bei geringer Vergrößerung und die Möglichkeit, einzelne zelluläre Bestandteile zu identifizieren. Eine unsachgemäße Herstellung der Geschosse oder eine Überfixierung des Gewebes kann zu einer schlechten Markierung führen, wie hier gezeigt.
Im Text werden Tipps zur Fehlerbehebung gegeben. Es ist ein konfokales Bild eines mittelgroßen spinnenden Neurons aus dem Maushirn dargestellt, das sein komplexes Muster dendritischer Verzweigungen zeigt. Die durch die konfokale Mikroskopie erzielte optische Schichtung ermöglicht die Isolierung einzelner markierter Zellen im Gewebeschnitt.
Bilder mit hoher Vergrößerung zeigen Dendritensegmente aus einem Nagetierhirn und einem nichtmenschlichen Primatenhirn. Beachten Sie die hohe Intensität der fluoreszierenden Färbung, die mit dieser Technik erzielt wird und zu gut definierten dendritischen Dornen führt, wenn die ICS mit der Immunfärbung kombiniert wird. Dieses Bild zeigt ein Beispiel der Kolokalisation der D-Auge-Markierung in Rot mit der Immunfärbung für die GFP-Expression in Grün.
Dieses Bild entspricht einem Schnitt aus dem Striatum einer transgenen Maus, die das fluoreszierende Protein GFP unter der Promotorregion des Dopaminrezeptors D1 exprimiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man Projektile herstellt und die Jing-Pistole verwendet, um Neuronen spärlich mit fluoreszierenden Farbstoffen zu beladen. Diese Technik ermöglicht die klare Visualisierung der neuronalen Morphologie sowie die Untersuchung der Dendritenverzweigung und der Dornfortsätze.
Übersicht
Diese Studie zeigt die Verwendung einer Genkanone, um fluoreszierende Farbstoffe in Neuronen von Gehirnschnitten von Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten einzubringen. Die Technik eignet sich zur Untersuchung der dendritischen Verzweigung und der Spinenmorphologie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neuroanatomie
- Fluoreszenzbildgebung
Hintergrund
- Die Genkanüttentechnik ermöglicht die gezielte Abgabe von Farbstoffen in Neuronen.
- Fluoreszierende Farbstoffe wie DiI werden zur Markierung neuronaler Strukturen verwendet.
- Diese Methode kann an Gehirnschnitten verschiedener Arten und Altersstufen angewendet werden.
- Die Kombination dieser Technik mit Immunfärbungen verbessert die Untersuchung der neuronalen Morphologie.
Zweck der Studie
- Einführung fluoreszierender Farbstoffe in Neuronen zu Abbildungszwecken.
- Untersuchung der dendritischen Verzweigung und der Spinenmorphologie bei verschiedenen Arten.
- Verbesserung bestehender Methoden zur Neuronenmarkierung.
Verwendete Methoden
- Beschichten von Wolfram-Perlen mit lipophiler Farbstofflösung.
- Verwendung einer Genkanone, um farbstoffbeschichtete Perlen in Gehirnschnitte einzuschießen.
- Optionale Immunfärbung zur zusätzlichen Lokalisierung von Markern.
- Hochauflösende Bildgebungstechniken wie die konfokale Mikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einführung fluoreszierender Farbstoffe in Neuronen.
- Sparse-Labeling, geeignet für hochauflösende Bildgebung.
- Nachgewiesene Wirksamkeit über verschiedene Arten und Altersstufen hinweg.
- Kombination mit Immunfärbung liefert detaillierte morphologische Einblicke.
Schlussfolgerungen
- Die Genkanonentechnik ist vielseitig einsetzbar für neuronale Untersuchungen.
- Sie ermöglicht die hochauflösende Abbildung dendritischer Strukturen.
- Diese Methode kann an verschiedene Forschungsanforderungen in der Neurowissenschaft angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mit der DiOLISTISCHEN Markierung ist eine hochauflösende, quantitative Analyse der neuronalen Morphologie in Gehirnschnitten aus verschiedenen Arten und Altersstufen möglich, wodurch die Einschränkungen transgenabhängig fluoreszierender Markierungsverfahren überwunden werden. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Entwicklungsrisikominderung und Zielvalidierung in entdeckungsorientierten neurobiologischen Arbeitsabläufen, insbesondere dort, wo eine translationale Kontinuität zwischen Nagetier- und nichtmenschlichen Primatenmodellen erforderlich ist. Die Verträglichkeit der Methode mit Immunfärbungen erhöht ihren Wert zusätzlich für multiplexe phänotypische Charakterisierungen und die Abstimmung von Biomarkern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuronalen Struktur zur Überprüfung mechanistischer Hypothesen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung der dendritischen Verzweigung und der Spinenmorphologie.
- Erleichtert die biologische Entschärfung von Risiken über verschiedene Arten und Genotypen hinweg, einschließlich nichtmenschlicher Primaten.
- Bietet eine Plattform für die multiplexe Markeranalyse mittels Kombinationen von Immunfärbungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Hirnschnittsysteme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening- oder phänotypische Assays vor.
- Ermöglicht reproduzierbare, spärliche fluoreszierende Markierung, die für quantitative Bildgebungsworkflows geeignet ist.
- Ermöglicht die Standardisierung von Assays über Altersgruppen und Arten hinweg und unterstützt die Erzeugung robuster Daten.
- Erlaubt eine zuverlässige Bewertung der neuronalen Morphologie als Reaktion auf experimentelle Störungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung morphologischer Messgrößen zwischen Nagetier- und nichtmenschlichen Primatenmodellen für die translationale Biomarker-Entwicklung.
- Stellt die Kontinuität von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem sie die Analyse über mehrere Arten hinweg unterstützt.
- Verringert das translationsbedingte Risiko, indem ein direkter Vergleich neuronaler Phänotypen zwischen Modellen ermöglicht wird.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf Grundlage quantitativer morphologischer Endpunkte.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die DiOLISTISCHE Markierung integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine inhaltsreiche morphologische Analyse sowohl in Nagetier- als auch in Primatengehirnschnitten ermöglicht und somit die Zielvalidierung, phänotypische Screening-Verfahren und translationsmedizinische Forschung unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Liefert quantitative morphologische Daten für die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen.
- Screening: Stellt reproduzierbare, versuchsfertige Hirnschnittpräparationen für die Substanz- oder genetische Screening-Analyse bereit.
- Analytik: Erzeugt hochauflösende, quantitative Bildgebungsdaten zur vergleichenden Analyse neuronaler Merkmale.
- Translationale Forschung: Verbindet Daten von Nagetieren und Primaten, um Biomarker abzugleichen und die präklinische Kontinuität sicherzustellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine breit anwendbare Markierungsplattform, die an verschiedene Arten, Altersstufen und experimentelle Kontexte angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung neuronaler Zielstrukturen und verringert mechanistische Unschärfen.
- Operativer Wert: Standardisiert die morphologische Markierung und Bildgebung über verschiedene Modelle und Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste, artenübergreifende Datenerhebung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung neurobiologischer Assets.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung von Gehirnschnitten, der fluoreszenten Markierung und der hochauflösenden Bildgebung.
- Benötigt Zugang zu Genkanonen-Geräten sowie zu konfokalen oder Zwei-Photonen-Mikroskopie-Plattformen.
- Erfordert eine strikte Standardisierung der Projektilherstellung und des Gewebemanagements zur Reproduzierbarkeit.
- Anpassbar an verschiedene Arten, Altersstufen und Fixierungsprotokolle, jedoch empfindlich gegenüber Gewebequalität und Markierungsparametern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Optimierung der Projektilqualität, des Fixierungsgrads und der Detergenskonzentration als entscheidende Erfolgsfaktoren.
