DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

Wir demonstrieren den Einsatz der Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DII, zu Neuronen in Hirnschnitten von Nagern und Primaten verschiedener Altersstufen einzuführen. In diesem speziellen Fall, verwenden wir erwachsenen Mäusen (3-6 Monate alt) und Erwachsenen cynomologus Affen (9-15 Jahre alt). Diese Technik, die ursprünglich von dem Labor von Dr. Lichtman beschrieben (Gan

Mein Name ist Gail Siebel und ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Veronica Alvarez am Nationalen Institut für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Kathleen Grant und Andrew Wow vom Oregon Primate Center und Dr. James Dene von der Wake Forest University durchgeführt, die das in dieser Studie verwendete nicht-menschliche Primatengewebe zur Verfügung stellten. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, Fluoreszenzfarbstoffe in Neuronen einzuführen und Gehirnschnitte verschiedener Spezies wie Nagetiere und Primaten jeden Alters zu markieren.

Zum Zwecke der Untersuchung der Morphologie von Dendriten und dendritischen Stacheln wird dies erreicht, indem zunächst Ts und Kügelchen mit einem lipophilen Farbstoff wie dem D-Auge beschichtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Schläuche mit D-Augen-beschichteten Kügelchen auszukleiden und in kleine Stücke zu schneiden, die als Geschosse für das Helios-Genpistolensystem dienen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, mit D-Augen beschichtete Kügelchen mit der Genkanone in Gehirnschnitte zu schießen.

Der letzte Schritt des Verfahrens ist optional, da die Stilistik mit der Immunfärbung kombiniert werden kann, um gleichzeitig andere Marker zu lokalisieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine spärliche Fluoreszenzmarkierung von Neuronen zeigen, die für hochauflösende Bildgebung geeignet sind, wie z. B. konfokale oder Zwei-Photonen-Mikroskopie, und die Untersuchung der dendritischen Verzweigung und der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden besteht darin, dass die Stilistik auf Gehirnschnitte von Tieren aller Arten, Altersgruppen und Genotypen angewendet werden kann.

Es kann in Kombination mit Immunfärbung verwendet werden und erzeugt eine spärliche Fluoreszenzmarkierung, die für die hochauflösende Mikroskopie vor der Herstellung von Kugeln geeignet ist. Wolframkügelchen mit lipophilem Farbstoff in einem chemischen Abzug bei 450 Millilitern Methylenchlorid auf 13,5 Milligramm lipophiles Farbstoffauge für eine Endkonzentration von 30 Milligramm pro Milliliter beschichten. Nehmen Sie ein Pre-Eloqua-Röhrchen mit 300 Milligramm Wolframkügelchen, fügen Sie 300 Mikroliter Methylenchlorid hinzu und spritzen Sie es kräftig, um die Kügelchen zu resuspendieren und eine homogene Lösung herzustellen.

Pro Bullet-Set werden nur 100 Milligramm Wolframkügelchen verwendet, indem man auf und ab pipettiert, um die Kügelchen resuspendiert zu halten, 100 Milliliter der Kügelchen und das aufgelöste Matrizenauge auf einen Objektträger geben und gründlich miteinander vermischen. Mit einer Pipettenspitze vollständig an der Luft trocknen lassen, bis die Kügelchen hellgrau werden. Lege ein sauberes Stück gewachstes weißes Papier mit einer sauberen Rennklinge unter die Rutsche. Schabere für jede Farbe der Kugeln die Perlen vom Glas, schiebe sie und würfele sie zu einem feinen Pulver.

Beschichtete Kügelchen auf Molkenpapier kratzen und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen geben. Fügen Sie drei Milliliter Wasser hinzu und beschallen Sie das Wasser 10 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Klumpen gründlich zu lösen. Schneiden Sie 0,7 Meter blaugrüne Schläuche mit einem Winkel an einem Ende ab und verbinden Sie das andere Ende mit einem Schlauchadapter mit einer 12-Milliliter-Spritze, legen Sie das freie Ende in ein Röhrchen mit 10 Millilitern einer 10 Milligramm pro Milliliter Polyvinylperon- oder PVP-Lösung und ziehen Sie die Lösung vollständig durch den Schlauch in die Spritze.

Wirbeln Sie die Bead-Lösung während des Pumpens mit der Spritze vor, um eine homogene Mischung zu erhalten, die schnell arbeitet, um eine Ausfällung der Beads zu vermeiden, und ziehen Sie die Lösung vollständig in den Schlauch. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen, die verhindern, dass sich die Perlen an dieser Stelle am Schlauch festsetzen, während der Schlauch von beiden Enden straff gehalten wird. Kippen Sie es von einer Seite zur anderen, um es gleichmäßig zu gestalten.

Verteile die Perlen. Führen Sie den Schlauch in die Vorbereitungsstation ein und lassen Sie die Kügelchen 30 bis 60 Sekunden lang absetzen. Verwenden Sie die Spritze langsam, aber sanft.

Entfernen Sie das Wasser und lassen Sie die Kügelchen zurück. Trennen Sie sofort die Spritze und beginnen Sie mit dem Drehen des Schlauchs. Stellen Sie den Stickstofffluss an der Vorbereitungsstation auf vier bis fünf LPM ein, trocknen Sie ihn 10 bis 20 Minuten lang, bis keine Wassertropfen mehr sichtbar sind.

Nehmen Sie den Schlauch aus der Vorbereitungsstation, schneiden Sie die Kugeln mit dem Schlauchschneider in 13 Millimeter lange Länge, und bei guten Kugeln wird ein schwacher grauer Schleier das Innere gleichmäßig überziehen. Legen Sie die Kugeln in mit Folie umwickelte Szintillationsfläschchen, die ein Trockenmittel wie wasserfreies Calciumsulfat enthalten. Lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis es zum Fotografieren bereit ist.

Mit der Diic-Markierung können Neuronen in Hirngewebe verschiedener Spezies und Altersgruppen gefärbt und mit verschiedenen Methoden konserviert werden. Platzieren Sie Gehirnscheiben, die entweder vor oder nach dem Schneiden fixiert wurden, in die Vertiefungen eines 24. Gut anrichten.

Waschen Sie die Scheiben in einem XPB S3 einmal für fünf bis 10 Minuten pro Waschgang. Pipettieren Sie das PBS mit einem Pinsel ab, um die Scheibe in der Vertiefung zu zentrieren. Platzieren Sie ein Stück 3,0-Mikrometer-Filter zwischen den beiden Metalldiffusionssieben am Ende der Laufauskleidung der Genpistole.

Halten Sie die Genkanone so, dass das Ende des Zylinderliners 1,5 Zentimeter von der Probe entfernt ist. Schießen Sie die Kügelchen mit 120 bis 180 PSI Heliumgasdruck in die Scheibe. Spülen Sie die Scheiben dreimal schnell mit einem XPBS ab, um überschüssige Farbe zu entfernen.

Achten Sie darauf, dass die Schussfläche der Scheibe während aller Schritte der Liquid-Handling nach oben zeigt. Lagern Sie die Scheiben drei bis sechs Stunden lang in PBS, damit sich der DAI entlang der mit Folie bedeckten Dendriten verteilen kann. Da dai lichtempfindlich ist, können die Scheiben in diesem Stadium montiert oder einer weiteren Färbung mit Antikörpern unterzogen werden, wie im nächsten Abschnitt beschrieben, um mit der Färbung bei 300 bis 500 Mikrolitern Permeationslösung fortzufahren, die 0,01 % TRITTON X 100 in einem XPBS pro Scheibe enthält, und genau 15 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Entfernen Sie die Permeationslösung aus den Vertiefungen, blockieren Sie die Scheiben in einer Lösung, die 10 % Ziegenserum und 0,01 % Tritan X 100 enthält, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zu jedem werden 300 bis 500 Mikroliter Primärantikörper in Blockierungslösung verdünnt. Gut inkubieren bei Raumtemperatur für ein bis zwei Stunden oder über Nacht, je nach Antikörperwaschscheiben dreimal mit einem XPBS für jeweils fünf bis 15 Minuten, dann nehmen Sie die Lösung aus der Vertiefung.

Zu jedem werden 300 bis 500 Mikroliter Sekundärantikörper in Blockierungslösung verdünnt. Viermal mit einem XPBS für jeweils fünf bis 15 Minuten wie zuvor gut waschen, die Scheiben auf einen Objektträger mit fluoreszierendem Eindeckmedium aufsetzen und mit einem 18 x 18 Millimeter großen Belag abdecken. Deckglas sechs bis 12 Stunden bei Raumtemperatur trocknen lassen, bevor die Ränder mit klarem Nagellack versiegelt, im Dunkeln gelagert oder bei vier Grad Celsius abgedeckt werden.

Beispielhafte Bilder von markierten Hirnschnitten sind hier zu sehen. Zwei wichtige Merkmale, auf die man achten sollte, sind ein spärliches Markierungsmuster bei geringer Vergrößerung und die Fähigkeit, einzelne zelluläre Komponenten zu identifizieren. Eine falsche Vorbereitung der Geschosse oder eine Überfixierung des Gewebes kann zu einer schlechten Beschriftung führen, wie hier gezeigt.

Tipps zur Fehlerbehebung finden Sie im Text hier. Es gibt ein konfokales Bild eines spinnierenden TAL-Neurons aus dem Gehirn der Maus und seinem komplexen Muster der dendritischen Verzweigung. Die optische Schnittbildung, die bei der konfokalen Mikroskopie erreicht wird, ermöglicht die Isolierung einzelner markierter Zellen im Gewebeschnitt.

Bilder mit hoher Vergrößerung zeigen Dendritensegmente aus einem Nagetiergehirn und einem nicht-menschlichen Primatengehirn. Beachten Sie, dass die hohe Intensität der Fluoreszenzfärbung, die mit dieser Technik erreicht wird, bei der Kombination von ICS mit Immunfärbung zu gut definierten dendritischen Dornen führt. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für die Kolokalisation der D-Augen-Markierung in Rot mit der Immunfärbung für die GFP-Expression in Grün.

Dieses Bild entspricht einer Sal-Scheibe einer transgenen Maus, die das fluoreszierende Protein GFP unter dem D-Eins-Dopaminrezeptor-Promotor exprimiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kugeln vorbereitet und die Jing-Pistole verwendet, um dünn anhaftende Neuronen mit fluoreszierenden Farbstoffen zu belasten. Diese Technik ermöglicht die klare Visualisierung der neuronalen Morphologie und die Untersuchung von Verzweigungen und Stacheln.