Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS)

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Durchführung einer differentiellen Bildgebung von zwei Ramen-Resonanzen, die mit biologischen Strukturen mit kohärenten Ramen-Streusignalen assoziiert sind. Die ersten drei synchronisierten Kurzpulslaser überlappen sich in Zeit und Raum. Die überlappenden Pulse werden dann an ein inverses Standardmikroskop gesendet, das die Erzeugung kohärenter Ramen-Signale von mikroskopischen Objekten ermöglicht.

Signale werden mit kommerzieller Software in Bilder umgewandelt, um verschiedene erzeugte Ramen-Signale zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Differenz zwischen Bildern, die aus doppelt und einfach resonanten Ramen-Signalen gewonnen wurden, eine erhöhte Empfindlichkeit für schwache Ramen-Signale bietet. Hallo, ich bin Tyler Weeks vom Center for Bio Photonics an der University of California Davis.

Ich bin Thomas ER vom Center for Bio Photonics und der Abteilung für Innere Medizin an der University of California Davis. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem Sie mit doppelt resonanter kohärenter Antis-Stokes-Ramen-Streuung chemisch spezifische Bilder von Zellen erzeugen können. Wir verwenden dieses Verfahren, um Signale von Molekülen zu detektieren, die zu schwach sind, um allein durch kohärente Antis-Stokes-Ramon-Spektroskopie direkt nachgewiesen zu werden.

Fangen wir also an: Um das Signal von Autos und Autos gleichzeitig zu erzeugen, werden drei abstimmbare und synchronisierte Kurzpuls-Laserquellen benötigt, um diese synchronisierten Pulse zu erhalten. Beginnen Sie mit einem einzelnen Kurzpulslaser mit einer Ausgangsleistung von 10 Watt. Eine feste Wellenlänge von 1064 Nanometern, eine feste Pulslänge von sieben Pikosekunden und eine feste Wiederholrate von 76 Megahertz.

Mit einer Reihe von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteilerwürfeln wird der Strahl in drei Teile geteilt. Eine halbe Platte in Kombination mit einem polarisierenden Strahlteilerwürfel ermöglicht die Einstellung der Leistung in jeder Komponente des Strahls, ohne seine Richtung zu ändern. In der Regel werden zwei Strahlen auf jeweils ca. 4,5 Watt eingestellt, und der dritte Strahl enthält das verbleibende Watt.

Die beiden Hochleistungsstrahlen werden dann in zwei unabhängige optisch-parametrische Oszillatoren (OPOs) gelenkt. OPOs verwenden eine unterschiedliche Frequenzerzeugung, um ein Photon mit hoher Energie in zwei Photonen mit niedrigerer Energie und unterschiedlichen Wellenlängen umzuwandeln. Durch die Steuerung der Temperatur des Kristalls, der zur Erzielung dieses Effekts verwendet wird, können die Wellenlängen der resultierenden Photonen auf 0,1 Nanometer genau gesteuert werden.

Durch die Verdopplung der Frequenz dieser Signale kann ein Laser mit einer festen Wellenlänge von 1064 Nanometern nun in einen Laserstrahl umgewandelt werden, der irgendwo zwischen 780 Nanometern und 910 Nanometern abgestimmt werden kann, indem zwei separate OPOs mit derselben 1064-Nanometer-Quelle gepumpt werden. Es erhalten zwei unabhängig voneinander abstimmbare Laserquellen, die automatisch mit unserem originalen Pumplaser synchronisiert werden. Der dritte Strahl des 1064 Nanometer großen Pumplasers wird durch eine Kombination von dielektrischen Spiegeln um die OPOs herum gelenkt, so dass alle drei Strahlen später wieder kombiniert werden können.

Um kohärente Ramen-Signalphotonen effizient zu erzeugen, müssen die rekombinierten Pulse sowohl zeitlich als auch räumlich überlappt werden, da OPOs Ringresonatoren enthalten, die es jedem Laserpuls ermöglichen, den Kristall mehrmals zu durchdringen, während der durch die OPOs gesendete Strahl eine zusätzliche Strecke zurücklegt, was zu einer erheblichen Verzögerung relativ zum ursprünglichen Pumpstrahl führt. Dieser Abstand muss durch einen dritten Strahl ausgeglichen werden, indem zusätzliche Spiegel eingeführt werden, die diesen Strahl zwingen, die gleiche Strecke wie die beiden anderen zurückzulegen, bevor sie mit dichroitischen Spiegeln rekombiniert werden, um eine Feineinstellung der Länge des Pfades zu ermöglichen. Jeder Strahl wird durch einstellbare Verzögerungsstufen geschickt, die es ermöglichen, die zeitliche Überlappung der verschiedenen Laserpulse einzustellen.

Jedem Strahl wird ein weiterer Satz von Halbplatten und polarisierenden Strahlteilerwürfeln hinzugefügt, um die Einstellung der Laserleistung jedes Strahls unabhängig voneinander zu ermöglichen. Mit dichroitischen Spiegeln werden zunächst die Strahlen der beiden OPOs kombiniert, dann muss mit dem 1064-Nanometer-Strahl darauf geachtet werden, dass sich die Strahlen im Raum präzise überlappen. Dies kann überprüft werden, indem man die Überlappung der Strahlen innerhalb weniger Zentimeter um den dichroitischen Spiegel mit denen vergleicht, die etwa einen Meter vom dichroitischen Spiegel entfernt sind.

Da die Exposition gegenüber Laserstrahlen mit hoher mittlerer Leistung die Probe beschädigen kann, werden die drei kombinierten Strahlen durch einen elektrischen optischen Modulator geleitet, der als Pulspicker fungiert und die Einstellung der Wiederholrate der Pulse, die bei der Probe ankommen, und damit der durchschnittlichen Leistung ermöglicht. Die kombinierten Laserstrahlen werden dann in ein inverses Mikroskop mit einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur (na) eingekoppelt. Die enge Fokussierung, die durch die Objektivlinse mit hoher NA erzeugt wird, ermöglicht die effizienteste Erzeugung kohärenter Ramen-Signale auf mikroskopischen Längenskalen.

Die Objektivlinse des Mikroskops ist auf einem X-, Y- und Z-Pizo-Tisch montiert, der es ermöglicht, Bilder durch Rasterabtastung der Strahlen über die Probe zu erhalten, ähnlich wie bei kommerziellen konfokalen Strahlmikroskopen. Sehen wir uns nun an, wie man Autos und D-R-F-W-M-Signale erzeugt: Die Wechselwirkung von drei Kurzpuls-Laserstrahlen an der Probe führt zur Erzeugung mehrerer vierwelliger Mischsignale, wie z. B. Autos aus den verschiedenen Kombinationen von zwei Lasern, sowie drei Farbautos und DR-Autosignale aus der Kombination aller drei Laser. Wenn die Wellenlänge der Signale relativ nahe beieinander liegt, kann es schwierig sein, sie für die Analyse zu trennen.

Aus diesem Grund werden die Signale in ein abbildendes Spektrometer geleitet, das auch als Monochromator oder Bandpassfilter dient, um Signale bei unterschiedlichen Wellenlängen räumlich zu trennen. Ein elektronisch betätigter Klappspiegel im Spektrometer in der abgesenkten Position sendet das Signal an ein rückwärtig beleuchtetes Deep Depletion Charge Coupled Device oder eine CCD-Kamera, die spektroskopische Informationen über den gesamten Signalbereich liefert und es uns ermöglicht, die verschiedenen kohärenten Robin-Signale zu identifizieren und zu optimieren, um das Signal für das Bild auszuwählen. Drehen Sie einfach die Gradierung innerhalb des Spektrometers mit der vom Hersteller bereitgestellten Steuerungs- und Datenerfassungssoftware, um den Peak of Interest auf der CCD-Kamera zu zentrieren.

Ändern Sie dann die Position des Flip-Spiegels, um das Signal zu einem zweiten Ausgang umzuleiten, an den ein Einzelphotonen-Zähl-Lawinenfoto-DDE oder ein PD angeschlossen ist. Raster. Scannen Sie die Objektivlinse und verwenden Sie dann die auf dem A PD aufgezeichneten Signale, um ein Bild zu erzeugen, indem Sie die Photonenzählrate für jedes Pixel mit der Datenerfassungssoftware anzeigen. Wiederholen Sie diesen bildgebenden Vorgang für jedes gewünschte kohärente Ramen-Signal, damit die Signale in der Nachbearbeitung verglichen werden können.

Sehen wir uns nun an, wie man eine Probe richtig vorbereitet, um klare, reproduzierbare Bilder zu erhalten. Bei der Vorbereitung der Proben ist eine gewisse Sorgfalt geboten. Die Proben werden in der Regel auf etwa 150 Mikrometer dicken Glasdeckscheiben vorbereitet.

Diese Deckgläser sind dünn genug, um eine hochauflösende Bildgebung mit den Wasser- oder Ölimmersionsobjektiven mit hoher NA zu ermöglichen, die in diesen Experimenten verwendet werden. Um die Vorbereitung einer typischen Probe zu demonstrieren, bereiten wir etwa 20 Mikrometer dicke Schnitte von Mausmuskelgewebe vor, die auf einem Objektträger befestigt sind. Ein 20-Mikroliter-Tröpfchen mit fünf molaren deuterierten Glukoselösungen wird der Probe zugesetzt.

Die deuterierte Glukoselösung sorgt für eine einzigartige und starke Ramen-Hintergrundsignatur. Ein Glasdeckglas wird auf die Probe gelegt und mit Nagellack für Zellen und Kultur fixiert. Es können Kulturschalen mit Glasboden verwendet werden, die eine Bildgebung ermöglichen, ohne dass die Zellen von ihren Zellkulturschalen abgenommen werden müssen.

Schauen wir uns nun an, wie man den richtigen Rum und die richtigen Spitzen für Dr. Cars bestimmt. Um den doppelt resonanten Verstärkungseffekt richtig nutzen zu können, müssen die Ramen-Spektren beider Ramen-Resonanzstoffe bekannt sein. Typischerweise sind dies 2.845 inverse Zentimeter, die mit Lipiden assoziiert sind, und 2.121 inverse Zentimeter für den CD-Dehnungsmodus, die mit der deuterierten Glukose assoziiert sind.

Eine kohärente Ramen-Streuung wird erreicht, wenn die Frequenzdifferenz zwischen zwei Lasern der Frequenz einer molekularen Schwingung entspricht. Durch die Abstimmung eines OPOs auf 817 Nanometer wird der 2.845 inverse Zentimeter C-Modus in Kombination mit dem 1064-Nanometer-Laserstrahl gemessen, und durch Einstellen des anderen OPO auf 868 Nanometer wird der 2.121 inverse Zentimeter in Kombination mit dem 1064-Nanometer-Strahl gemessen. Im spektroskopischen Modus können wir mit dem Mikroskop des Autos drei kohärente Ramen-Signale von Interesse beobachten, ein Autosignal, das die CH-Dehnungsschwingung untersucht, ein Autosignal, das den CD-Dehnungsmodus untersucht, und ein DR-Autosignal, das beide in dem hier gezeigten Diagramm sondiert, gestrichelte Pfeile zeigen Photonen vom Laser in den OPOs und durchgezogene Pfeile zeigen das resultierende Signal an.

Die durchgezogenen horizontalen Linien zeigen die Energie der Ramen-Schwingung an und geben eine visuelle Darstellung, dass in DR-Autos, die dieselben drei Eingangsphotonen gleichzeitig mischen, zwei verschiedene Ramen-Schwingungen untersuchen. Die Signalstärke für jeden Peak muss optimiert werden, indem diese Peak-Positionen in feinen Schritten abgestimmt werden. Hier wählen wir jeden Peak aus und nehmen Bilder von Seeelganwürmern in einer Lösung aus degradierter Glukose auf. Die Extraktion zusätzlicher Informationen auf der Grundlage dieser drei einzeln erhaltenen Bilder erfordert eine ziemlich einfache Bildverarbeitung.

Zuerst müssen die Bilder normalisiert werden. Eine praktische Methode zur Normalisierung beruht auf der Tatsache, dass Lipide hydrophob sind. Das bedeutet, dass in Regionen mit Lipiden hoher Dichte die CD-Resonanz aus der Glukose nur sehr wenig zum Doppelresonanzsignal beitragen sollte.

Umgekehrt sollten in Regionen mit reiner Glukoselösung auch die CH-Resonanzen aus den Lipiden nur sehr wenig beitragen. In diesem Sinne normalisieren Sie das Bild des DR-Autos und das Bild des Autos, das auf der CD-Resonanz der deuterierten Glukoselösung erhalten wurde, auf eine Region, die weit außerhalb des CL-Egan-Wurms liegt und keine CH-Resonanz aufweisen sollte. Identifizieren Sie als Nächstes eine Region innerhalb des Wurms im CH-resonanten Autobild, die reich an Lipiden ist, und normalisieren Sie sie auf die entsprechende Region innerhalb des normalisierten DR-Autobildes.

Damit diese Methode richtig funktioniert, gehen Sie davon aus, dass tief in dieser Region keine deuterierte Glukose vorhanden ist. Dies ist eine sichere Annahme, da die Lipide hydrophob sind und sich nicht mit der Lösung vermischen. Wenn man nun das normalisierte CH-Resonanz-Autobild vom normalisierten DR-Autobild subtrahiert, bleibt nur das verstärkte CD-Resonanzsignal übrig, indem das normalisierte CD-Resonanz-Autobild vom normalisierten Dr.FWM-Bild subtrahiert wird.

Nur das verstärkte ch-Resonanzsignal, das hier übrig bleibt, ist das Ramen-Spektrum für eine modifizierte Ölsäure, das eine Alkin-Modifikation enthält, die starken CH-Resonanzen bei 2.845 inversen Zentimetern und die alpine Resonanz bei 2.121 inversen Zentimetern sind beide gut von der Fingerabdruckregion isoliert, die die Region der dicht gepackten Peaks ist. Damit sind sie ideale Marker für eine kohärente Ramen-Bildgebung. Dies ist ein typisches Spektrum kohärenter Ramen-Signale, das erzeugt wird, wenn drei Kurzpulslaser innerhalb der Probe überlappt werden. Die Pfeile zeigen auf die Prozesse, die für jedes Signal verantwortlich sind, wie sie durch Energiediagramme dargestellt werden.

Dies sind typische Ergebnisse der Bildgebung von C Elgin-Würmern mit DR-Autos und Autos. Die obere Reihe verwendete die drei gerade gezeigten Signale, um einen Wurm in einer Lösung aus debewerteter Glukose abzubilden. In der zweiten Reihe wurden die Bilder entsprechend normalisiert und in der dritten Reihe wurden die Differenzbilder erstellt. Indem wir jedes der Bilder des Autos vom Bild des DR-Autos subtrahiert haben, haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Raman-Differenzbildgebung auf der Grundlage der doppelt resonanten kohärenten Anti-Raman-Mikroskopie durchführen können.

Denken Sie bei diesem Verfahren daran, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass die Balken überlappen und ordnungsgemäß synchronisiert sind. Achten Sie beim Umschalten zwischen verschiedenen kohärenten Signalen darauf, die Probe nicht zu stoßen oder zu bewegen, da dies die Analyse beeinträchtigt. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.