Name: Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Lernen Sie die doppelt-resonante CARS-Mikroskopie zur bildgebenden Darstellung biologischer Strukturen mit verbesserter Empfindlichkeit für schwache Raman-Signale. Diese Methode ermöglicht chemisch spezifische Zellbildgebung.

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Wir möchten Iwan Schie und Sebastian Wachsmann-Hogiu für ihre Beiträge bei der Entwicklung der DR-CARS-Technik. Tyler Wochen dankt für die Unterstützung durch die Lawrence Scholar Program von Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser ist dankbar für Unterstützung durch die American Heart Association durch die Grant-in-Aid-Programm. Diese Arbeit wurde zum Teil auch aus Mitteln der National Science Foundation unterstützt. Das Zentrum für Biophotonik, ein NSF Science and Technology Center, wird von der University of California, Davis gelungen, unter Cooperative Agreement Nr. 0120999 PHY. Unterstützung wird auch von der UCD Clinical Translational Science Center unter dem Förderkennzeichen UL1 RR024146 vom National Center for Research Resources (NCRR) anerkannt.

1. Generation von Autos und DR-CARS-Signale Zur Erzeugung CARS und DR-CARS-Signale gleichzeitig, drei einstellbare und synchronisiert kurz gepulsten Laserquellen erforderlich sind. <ol><li> Um drei synchronisierten Impulse beginnen wir mit einer Einzeldosis von 10 W Laser (PicoTrain, HighQ-Laser, Inc.). Dieser Laser hat eine feste Wellenlänge von 1064 nm, eine feste Pulsdauer von 7 ps und einer festen Repetitionsrate von 76 MHz. </li><li> Mit einer Reihe von Halbwellen-Platten und polarisierende Strahlteilerwürfel des Strahls in drei Teile aufgeteilt ist. Ein Halbwellenplatte mit einer polarisierenden Strahlteilerwürfel kombiniert ermöglicht es uns, die Menge an Energie in jeder Komponente des Strahls einstellen, ohne seine Richtung. Typischerweise werden zwei Strahlen auf ~ 4,5 W jeweils angepasst, und der dritte Strahl enthält die restlichen 1 W. </li><li> Die beiden Hochleistungs-Strahlen werden dann in zwei unabhängige optische parametrische Oszillatoren (OPO ist, Avante, APE GmbH, Berlin, Deutschland) geleitet. OPO die Nutzung Differenzfrequenz Generation auf ein höheres Energieniveau Photon in zwei Photonen von niedrigerer Energie umwandeln mit unterschiedlichen Wellenlängen. Durch die Steuerung der Temperatur des Kristalls verwendet werden, um diesen Effekt zu erzielen, können die Wellenlängen der entstehenden Photonen auf 0,1 nm gesteuert werden. Durch Frequenzverdopplung diesen Signalen ein Laser mit einer festen Wellenlänge von 1064 nm kann nun in einen Laserstrahl, der irgendwo zwischen 780 nm bis 910 nm abgestimmt werden verwandelt werden. Durch Pumpen zwei separate OPO ist mit der gleichen 1064 nm Quelle, erhalten wir zwei unabhängig abstimmbaren Laserquellen, die automatisch an unserer ursprünglichen Pumplaser synchronisiert sind. </li><li> Die dritte (niedrigste Leistung) Strahl aus der 1064 nm Pumplaser ist rund um die OPO ist durch eine Kombination von dichroitischen Spiegeln, so dass alle drei Strahlen (2 aus dem OPOs, 1 aus dem Pumplaser) später wieder zusammengeführt werden können gerichtet. Um effizient zu produzieren kohärente Raman-Signal Photonen der rekombiniert Impulse müssen sowohl zeitlich als auch räumlich überlagert werden. Da OPO Ring Hohlräume enthalten, so dass jeder Laserpuls durch den Kristall mehrfach übergeben, die Balken durch die OPO Reise-sandte einen zusätzlichen Abstand was zu einer erheblichen Verzögerung gegenüber dem ursprünglichen Pumpstrahl. Dieser Abstand muss mit dem dritten Strahl werden durch die Einführung von zusätzlichen Spiegeln, dass dieser Strahl auf den gleichen Abstand wie die beiden anderen zu reisen, bevor sie wieder zusammengeführt werden mit dichroitischen Spiegeln Kraft kompensiert. </li><li> Um die Feineinstellung der Länge des Weges jeder Strahl reist einstellbarer Verzögerung Stufen, mit Prisma Retroreflektoren sind in jedem Strahlengang eingebracht sind. </li><li> Ein weiterer Satz von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteiler Würfel sind zu jedem Balken hinzugefügt, damit wir die Leistung der einzelnen Strahl unabhängig, ohne die Eingabe des OPO ist anzupassen. </li><li> Dichroitische Spiegel werden verwendet, um erste Mähdrescher die Strahlen aus den beiden OPO und dann mit der 1064 nm Strahl. Es muss darauf geachtet, um sicherzustellen, dass die Strahlen genau überlappen (dh sie sind kollinear und haben ähnliche Divergenz) werden. Dies kann durch den Vergleich der Überlappung der Balken in der Nähe (innerhalb von ein paar Zentimeter) und weit davon entfernt (ca. 1 m) der dichroitische Spiegel überprüft werden. </li><li> Der Vorteil der Verwendung von gepulsten Lasern ist, dass jeder Impuls kann eine hohe Spitzenleistung Energie bei der Probe haben, so dass für eine effiziente Erzeugung kohärenter Raman-Signale, unter Beibehaltung einer niedrigen durchschnittlichen Intensität. Eine hohe durchschnittliche Intensität kann zu einer Beschädigung der Probe. Deshalb, um weitere Kontrolle der durchschnittlichen Intensität, ohne dabei den Höhepunkt der Energieproduktion, sind die drei kombinierten Strahlen durch einen elektro-optischen Modulator (Pockels-Zelle, ConOptics) Funktion als Pulspicker, die uns auf die Wiederholrate der Impulse, die zu justieren geschickt kommen zu unserer Stichprobe und damit die durchschnittliche Intensität. </li><li> Die kombinierte Laserstrahlen werden dann in einem inversen Mikroskop mit einer hohen NA Ziel gekoppelt. Das Ziel ist in der Regel eine 60 X Wasser Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 1,2, dass die chromatische Aberration wurde über den Bereich der Einstellbarkeit unserer OPO und der 1064 nm Strahl korrigiert. Die enge Fokussierung durch die hohe NA Objektiv erzeugt ermöglicht die effiziente Erzeugung von kohärenter Raman-Signale auf der Mikrometer-Skala. </li><li> Die kombinierte Strahlen erweitert, um die Back-Port des Mikroskop-Objektivs überfüllen. Durch Überfüllung der Rückseite des Mikroskop-Objektivs erreichen wir die beste Fokussierung Bedingungen und sind daher die beste räumliche Auflösung in unserem Mikroskop-System. </li><li> Das Objektiv in unserem Mikroskop basiert auf einem XYZ Piezo-Bühne, die uns Bilder von Raster-Scan-Balken über der Probe, ähnlich wie bei kommerziellen Strahl-konfokalen Mikroskopen erhalten können montiert. </li></ol> 2. Die Verwendung von drei Short gepulsten Lasern Die Verwendung von drei kurzen gepulsten Lasern führt zur Produktion von mehreren CARS-Signale aus den verschiedenen combinations von zwei Lasern sowie 3-Color CARS und DR-FWM-Signale aus der Kombination von allen drei Lasern. <ol><li> Die Wellenlängen der Signale kann spektral nahe beieinander liegen. Wenn die Signale nahe beieinander sind, kann es schwierig sein, sie für die Analyse mit festen Wellenlänge Bandpass-Filter und dichroitische Spiegel zu trennen. Aus diesem Grund unsere Signale werden in einem bildgebenden Spektrometer (SpectraPro 2300i, Acton Research), der auch als eine effiziente Monochromator räumlich getrennte Signale bei verschiedenen Wellenlängen weitergegeben. </li><li> Ein elektronisch betätigte Klappspiegel innerhalb des Spektrometers in der abgesenkten Position sendet das Signal an einen Back-beleuchteten tief-Depletion charge-coupled device (CCD)-Kamera, die spektroskopische Information bietet über den gesamten Signalbereich und erlaubt uns, zu identifizieren und optimieren die verschiedenen kohärente Raman-Signale. </li><li> So wählen Sie das Signal, mit denen wollen wir Bild, das wir drehen Sie einfach das Gitter im Spektrometer, mit dem vom Anbieter bereitgestellten Steuerung und Datenerfassung (WinSpec, Princeton Instruments), zum Zentrum der Spitze der Zinsen auf die CCD-Kamera und ändern Sie dann die Position der Klappspiegel, dieses Signal zu einem zweiten Ausfahrt Port, an den Ein-Photon-Counting-Lawine Fotodiode (APD) angefügt wurde umgeleitet. </li><li> Das Objektiv wird dann Raster-gescannt und die Signale auf dem APD erfasst werden verwendet, um ein Bild, indem sie die Photonen-Zählrate für jedes Pixel über Datenerfassungs-Software (SymPhoTime, PicoQuant GmbH, Berlin, Deutschland) zu generieren. </li><li> Wir wiederholen dieses bildgebenden Verfahrens für jede gewünschte kohärente Raman-Signal, das uns die Signale während der Nachbearbeitung zu vergleichen. </li></ol> 3. Probenvorbereitung Um klare und reproduzierbare Bilder zu erhalten einige Vorsicht bei der Vorbereitung der Probe entnommen werden. <ol><li> Die Proben werden in der Regel auf ~ 150 Mikrometer dicken Deckgläser vorbereitet. Diese Deckgläser sind dünn genug, um für die hochauflösende Bildgebung mit der 1,2 NA Ziele, die typischerweise verwendet werden können. </li><li> Optische Einfangen von dielektrischen Objekten kann auftreten, wenn das Laserlicht gebeugt wird durch kleine transparente Objekte. Der Einsatz von gezielter, hoher Spitzenleistung, können kurz gepulsten Laserstrahlen ziehen kleine Zellen oder Bakterien an, was zu verschwommen oder verschmiert Bilder. Um dies zu vermeiden, kann es notwendig sein, um die Probe auf die Oberfläche des Deckglases immobilisieren, indem zunächst eine dünne Schicht aus Poly-L-Lysin durch Spin-Coating. </li><li> Für Zellen in Kultur Glasboden Kulturschalen genutzt, die es für die Bildgebung, ohne dass die Zellen aus ihren Zellkulturen Wachstum Gerichte zu lösen sein. </li><li> Zur Demonstration in diesem Beitrag haben wir die erste Einzahlung eines Formaldehyd-fixierten C. elegans Fadenwurm auf einem Deckglas. </li><li> Dann fügen Sie eine 20 uL Tropfen 5 M deuterierte Glucose-Lösung, um den Wurm. Die deuterierte Glucose-Lösung bietet eine einzigartige und starke Raman Hintergrund Signatur. </li></ol> 4. Probenanalyse Um richtig nutzen die doppelt resonante Verstärkung Effekt der Raman-Spektren der beiden Raman-Resonanz-Stoffe bekannt sein. <ol><li> Sobald die Probe wird auf dem Deckglas wird analysiert, mit einem konfokalen Raman-Mikroskop auf die maßgeblichen spontane Raman-Spektrum zu erhalten und geeignete Gipfel vorbereitet. </li><li> Um DR-CARS identifizieren wir die spektralen Lagen der CH Stretch-Modus, in der Regel mit Lipiden assoziiert, und die CD Stretch-Modus, im Zusammenhang mit dem deuterierten Glukose, um 2845 cm -1 und 2121 cm -1 bzw. werden. </li><li> Coherent Raman-Streuung ist erreicht, wenn die Frequenzdifferenz zwischen zwei Laser entspricht der Frequenz einer molekularen Schwingung. Durch die Abstimmung ein OPO bis 817 nm wird die Sonde 2845 cm -1 CH-Modus, wenn mit der 1064 nm Laserstrahl und durch Abstimmung der anderen OPO bis 868 nm wird es den 2121 cm -1 Peak-Sonde, wenn sie mit der 1064 nm Strahl kombiniert kombiniert . </li><li> Mit Raster-Scan der Probe auf dem CARS-Mikroskop wir jetzt beobachten können drei zusammenhängenden Raman-Signale von Interesse. A CARS-Signal Sondierung der CH-Valenzschwingung, signalisieren eine CARS Sondieren der CD Stretch-Modus, und ein DR-CARS-Signal Sondierung beide. </li><li> Wir wählen jeden Peak, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben und nehmen Sie ein Bild wie oben beschrieben. </li></ol> 5. Image Processing Extrahieren zusätzliche Informationen über diese drei Bilder basieren erfordert nun einige ziemlich einfache Bildbearbeitung. <ol><li> Zunächst müssen die Bilder normalisiert werden. In der Theorie Normalisierung kann durch Berücksichtigung der Intensität der einzelnen Laser in jedes Signal Generation beteiligt erreicht werden. In der Praxis wird jedoch diese nicht immer funktioniert, vor allem aufgrund der uneinheitlichen spektrale Empfindlichkeitder dichroitische Spiegel, Detektoren und Gitterroste. </li><li> Eine praktische Methode zur Normalisierung beruht auf der Tatsache, dass in Regionen, in denen reine Lipide dominieren das Signal, das CD-Resonanz sollte keiner der das Signal beitragen. Ebenso in den Regionen der reinen Glucose-Lösung der CH-Resonanz sollte keiner der das Signal beitragen. In diesem Sinne, normalisieren wir die DR-CARS Bild und die CARS Bild auf dem CD-Resonanz des deuterierten Glukose-Lösung zu einer Region auch außerhalb der C erhalten elegans-Wurm, der keine CH-Resonanz zeigen sollte. </li><li> Dann ermitteln wir eine Region innerhalb der Wurm in der CH-Resonanz-CARS Bild, das reich an Lipiden und normalisieren sie die entsprechende Region in der normierten DR-CARS Bild. Für diese Methode richtig funktioniert wir annehmen, dass tief in dieser Region keine deuterierten Glukose vorhanden ist. Dies ist eine sichere Annahme, da die Lipide hydrophob sind und nicht mit der Lösung zu vermischen. </li><li> Jetzt, durch Subtraktion der normierten CH-Resonanz-CARS Bild aus dem normalisierten DR-CARS Bild sind wir nur mit dem verstärkten CD-Resonanz-Signal links. </li><li> Ebenso durch Subtraktion der normierten CD-Resonanz-CARS Bild aus dem normalisierten DR-FWM Bild sind wir nur mit dem verstärkten CH-Resonanz-Signal links. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der DR-CARS-Mikroskopie-System wie oben beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Weißes Licht Bild einer C. elegans Wurm in deuterierten Glukose-Lösung auf einem Deckglas vorbereitet und bereit für die Bildgebung. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3:. Raman-Spektrum des modifizierten Ölsäure (eine ungesättigte Fettsäure), dass ein Alkin Modifikation (ein Kohlenstoff-Dreifachbindung Kohlenstoff-Gruppe) umfasst die starke CH-Resonanzen bei 2845 cm -1 und die Alkin-Resonanz bei 2100 cm -1 sind beide auch von der Fingerprint-Bereich (der Bereich von dicht gepackten Peaks) isoliert, wodurch sie ideal Marker für eine kohärente Raman Imaging. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4:. Typisches Spektrum kohärenter Raman-Signale generiert, wenn drei Kurzzeit-gepulste Laser in der Probe überlagert sind Die Pfeile zeigen auf den Prozess (es) für jedes Signal, wie Energie-Diagrammen dargestellt. In den Diagrammen hier gezeigten gestrichelten Pfeile Photonen aus dem Laser und der OPO-und durchgezogene Pfeile zeigen die resultierende Signal. Die durchgezogene horizontale Linien geben die Energie der Raman Vibrationen und geben eine visuelle Darstellung, dass DR-CARS, das Mischen der gleichen 3-Eingang Photonen gleichzeitig zwei verschiedene Sonden-Raman-Schwingungen. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: Typische Ergebnisse von bildgebenden C. elegans Würmer mit DR-Autos und Fahrzeuge. Die oberste Zeile verwendet die drei Signale in Abbildung 4 dargestellt, um Bild ein Wurm in einer Lösung von deuterierten Glukose. In der zweiten Reihe wurden die Bilder entsprechend normalisiert und in der dritten Reihe die Differenz Bilder wurden durch Subtraktion jeder der CARS Bilder aus dem DR-CARS Bild produziert.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
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<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
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<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

Raman-Spektroskopie und Raman-basierten Imaging sind mächtig aufstrebenden Werkzeuge in der Bio-Wissenschaften. Derzeit ist dies insbesondere für die in vivo und in vitro-Studie des Zellstoffwechsels und Stoffwechselstörungen in der Verarbeitung und Lagerung von Lipiden. Die meisten Bio-Makromolekülen enthalten eine große Anzahl von ähnlichen, meist Kohlenstoff basierenden molekularen Bindungen, so dass die Raman-Spektren von Zellen und Organismen gewonnen sind typischerweise eine Faltung der Beiträge aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Zucker, etc. sind Lipide relativ einfach Aus diesen komplexen Spektren zu isolieren, die aufgrund ihrer Neigung zu dichten Tröpfchen oder Lipid-Doppelschichten bilden, und weil sie enthalten lange Ketten mit einer großen Anzahl von aliphatischen CH-Bindungen. Unsere Fähigkeit, spezifische Proteine, Aminosäuren, RNA oder DNA innerhalb der komplexen zellulären Umgebung zu isolieren ist jedoch sehr begrenzt. Dies gilt insbesondere, wenn diese Moleküle von Interesse nur anwesend uM Konzentrationen und unten sind. Hier bietet die Möglichkeit, schwache Raman-Resonanzen Nutzung unserer neu eingeführten DR-CARS Unterschied bildgebendes Verfahren Sonde eine potentiell mächtige Ansatz für ihre chemische Mikroanalyse und Bildgebung. Zwar ist die komplizierteste Teil dieses Protokoll die Ausrichtung und die Synchronisation des Lasersystems. Beim Start aus dem Nichts, die Synchronisation der Impulse, dh der Sicherstellung, dass die Impulse in der Zeit sind trotz der unterschiedlichen Wege, die sie ergreifen können durch die Verwendung eines Impulses Autokorrelator erleichtert werden überlagert. Sobald räumliche und zeitliche Überlappung erreicht wird, CARS und DR-CARS-Signale sollten leicht nachweisbar. Allerdings ist die erste Ausrichtung oft roh, was zu schwachen Signalen. Die Best Practice für die Ausrichtung dieses System gut ist es, zunächst erzeugen schwache Signale und dann die Signalstärke, indem Sie vorsichtig die Feinabstimmung des Spiegel entlang jeder Pfad und die Anpassung der zeitlichen Überschneidung mit den Verzögerungsstufen zu verbessern. Obwohl das Spektrometer / Monochromator wirkt wie eine sehr effiziente Schallwand für Raumlicht die saubersten Ergebnisse durch den Betrieb des Systems mit der Raumbeleuchtung erreicht werden kann, ausgeschaltet und die Vorhänge oder Objektiv-Schlauch in den Hintergrund durch die verschiedenen anderen Lichtquellen (zB Computer-Monitoren eingeführt zu minimieren, Anzeige leuchtet, LEDs, etc.). Unsere speziellen Setup nutzt Single-Photon-Counting-Lawine Fotodiode (APD)-Detektoren und zeitlich korreliert Single Photon Counting (TCSPC) Hardware für den Nachweis 5. Dies ermöglicht es uns, extrem schwache Signale mit relativ geringem Rauschen, aber viele Gruppen haben Photomultiplier-Röhren (PMT) mit variabler Verstärkung von Vorteil, wenn bei ähnlichen Messungen gefunden zu erkennen. Der Vorteil von PMT ist, dass sie mit variablem Verstärkungsfaktor bieten und haben einen viel größeren Erfassungsbereich, die Ausrichtung des Detektors vereinfachen können. Darüber hinaus nutzt unser Setup Piezo-Stufen, um das Ziel zu übersetzen, um Strahlschwenkung zu erreichen. Der Vorteil davon ist, dass wir die Fähigkeit, sich an jeder beliebigen Stelle innerhalb der zuvor gescannten Bild zurück mit einem hohen Maß an Genauigkeit und nehmen zusätzliche Messungen einschließlich spontaner Raman-Spektren haben. Andere Gruppen waren erfolgreich nutzen Scanspiegel Baugruppen oder sogar ganze konfokalen Scanning-Einheiten wie den Olympus FluoView System, das viel schneller Bildgebung bietet aber in seiner Fähigkeit, genau an beliebige Orte zurückzukehren innerhalb eines Bildes begrenzt. Tuning der Laser passend zum Raman-Resonanz ist auch ein entscheidender Schritt, dass einige Optimierungen erfordern. Obwohl der Raman-Peaks die maximale spektrale Peak-Intensität von DR-Autos und Fahrzeuge erhalten erkennen kann, nicht unbedingt das Maximum der spontanen Raman-Peak entspricht. Dies ist auf die intrinsische Beeinflussung der Signale durch Vierwellenmischung führt zu einer nicht-resonanten Hintergrund-Signal und Autos, die CARS-Spektren relativ zur spontanen Raman-Spektren verzerrt generiert. Die spektrale Lage der Spitze des CARS-Signals berechnet werden, sondern ein praktischer Ansatz ist, die OPOs in mehreren, kleinen spektralen Schritte über die erwartete Lage der Raman-Resonanz-Melodie. Dieser Prozess sollte Ertrag ein deutliches Maximum. In der Tat, für die größte Empfindlichkeit von DR-FWM beiden Resonanzen muss zu diesem Maximum eingestellt werden. Eine letzte mögliche Problem der DR-CARS Ansatz muss auch diskutiert werden, dh die DR-CARS-Signal wird auf eine homogene Verteilung der Raman-aktiven Verstärkung Molekül ab. Für die meisten biologischen Objekten, könnte dies auch der breiten OH-Resonanz von Wasser, das reichlich und fast allgegenwärtig ist. Wasser ist jedoch aus hydrophoben Regionen mit einer Zelle, wie Fetttröpfchen, was zu einer Verzerrung der Signale erreicht, wenn mit dem Wasser Resonanz auf Lipid-Modi verstärken ausgeschlossen. In unserem Beispiel haben wir eine Lösung von deuterierten Glukose verwendet, um eine leicht erkennbare und reichlich Signal für unsere biologischen Probe zu erzeugen. Ebenso deuteriertem Wasser oder deuterierten biologischen buffers, wie d-HEPES verwendet werden könnte. In unserem Beispiel Tröpfchen der Lipid innerhalb der C. elegans Wurms waren klein genug, um immer enthalten sowohl die deuterierte Glucose-Lösung und Lipiden innerhalb der fokussierten Laserspot unseres Systems. Dies ist jedoch in der Regel nicht wahr. Ein besonderes Beispiel würde Adipozyten, die ziemlich großen Fetttröpfchen erzeugen in ihrem Zytoplasma werden. Dies bedeutet, erfordert jedes Experiment mit dem DR-CARS-Technik durchgeführt sorgfältige Vorbereitung und Kontrolle Experimente, um die Ergebnisse zu überprüfen.

<table><tbody><tr><td>60X-Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>Pockels-Zelle</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>Picotrain-Pump-Laser</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Parametrischer Oszillator</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Glas-Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Halbwellenplatten</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>Polarisierende Strahlteilerwürfel</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 oder PBS053</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometer/Monochromator</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>Lawinen-Fotodioden</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>XYZ-Piezo-Stage</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>Dies ist eine Kombination aus einer XY-Stage und einem Z-Objektivhalter</td></tr><tr><td>Dichroitische Spiegel</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>Diese spezifischen dichroitischen Spiegel sind nicht entscheidend; jede Kombination mit geeigneten Transmissions-/Reflexionseigenschaften ist ausreichend.</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>Zur Kombination der verschiedenen nahinfraroten Laserstrahlen</td></tr><tr><td>TCSPC-Board</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Symphotime-Abbildungssoftware</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differential imaging biologischer strukturen mit doppelt-resonanten kohärente anti-stokes raman-streuung (cars)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman Imaging-Techniken haben einen dramatischen Anstieg der Aktivität in den letzten zehn Jahren durch ihr Versprechen, label-free optische Bildgebung mit hoher Spezifität molekularer 1 zu ermöglichen gesehen. Die Sensitivität dieser Techniken ist jedoch um viele Größenordnungen schwächer als Fluoreszenz, erfordern milli-molaren molekularen Konzentrationen 1,2. Hier beschreiben wir eine Technik, die die Detektion von schwachen oder niedrige Konzentrationen von Raman-aktiven Molekülen durch Verstärkung ihrer Signal mit, dass aus stark oder reich Raman Streuer gewonnen werden können. Das Zusammenspiel von kurzen gepulsten Lasern in einer biologischen Probe erzeugt eine Vielzahl von kohärenten Raman-Streuung Signale, von denen jede einzigartige chemische Informationen über die Probe zu tragen. In der Regel ist nur eines dieser Signale, zB kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS), verwendet, um ein Bild zu erzeugen, während die anderen verworfen. Wenn jedoch diese anderen Signale, einschließlich 3-Farb-CARS und Vierwellenmischung (FWM), gesammelt und im Vergleich zu den CARS-Signal, da sonst schwer zu erkennen, Informationen 3 extrahiert werden. Zum Beispiel, ist doppelt-resonanten CARS (DR-CARS) das Ergebnis der konstruktiven Interferenz zwischen zwei Resonanz-Signale 4. Wir zeigen, wie Abstimmung der drei Laser benötigt, um DR-CARS-Signale, die 2845 cm -1 CH Streckschwingung in Lipiden und den 2120 cm -1 CD-Valenzschwingung einer deuterierten Moleküle (zB deuterierte Zucker, Fettsäuren, etc.) produzieren kann genutzt werden, um sowohl Raman-Resonanzen gleichzeitig Sonde werden. Unter diesen Bedingungen zusätzlich zu den CARS-Signale von jedem Resonanz, eine kombinierte DR-CARS-Signal Sondierung beide auch generiert wird. Wir zeigen, wie Erfassung der Differenz zwischen dem DR-CARS-Signal und die Verstärkung Signal von einer reichlichen Moleküls Schwingungen kann die Empfindlichkeit für das schwächere Signal zu verstärken. Wir zeigen ferner, dass dieser Ansatz erstreckt sich sogar auf Anwendungen, bei denen sowohl Signale von verschiedenen Molekülen erzeugt werden, so dass z. B. durch die starke Raman-Signal von einem Lösungsmittel kann die schwache Raman-Signal von einer verdünnten gelöste verbessern.

Eine Kombination von drei einzigen Wellenlänge kurz gepulsten Lasern wird verwendet, um kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) und doppelt-Resonanz-CARS (DR-CARS) zu generieren. Die Differenz zwischen diesen Signalen bietet eine verbesserte Empfindlichkeit für sonst schwer kohärente Raman-Signale zu erkennen, so dass bildgebende der schwachen Raman Streuer.

Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS)

Techniken der kohärenten Raman-Bildgebung haben in den letzten zehn Jahren einen dramatischen Zuwachs an Aktivität erfahren, da sie die Aussicht auf eine markierungsfreie optische Bildgebung bieten ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur differentiellen Abbildung zweier Ramen-Resonanzen, die mit biologischen Strukturen assoziiert sind, mittels kohärenter Ramen-Streuungssignale. Zunächst werden drei synchronisierte Kurzpulslaser zeitlich und räumlich überlappt. Die überlappten Pulse werden anschließend an ein Standard-Invertiertmikroskop geleitet, das die Erzeugung kohärenter Ramen-Signale aus mikroskopischen Objekten ermöglicht.Signale werden mithilfe kommerzieller Software in Bilder umgewandelt, um verschiedene erzeugte Ramen-Signale zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Unterschied zwischen Bildern, die aus doppelt und einfach resonanten Ramen-Signalen gewonnen wurden, eine verbesserte Empfindlichkeit für schwache Ramen-Signale ermöglicht. Hallo, ich bin Tyler Weeks vom Zentrum für Bio-Photonik an der University of California Davis.Ich bin Thomas ER vom Zentrum für Bio-Photonik und der Abteilung für Innere Medizin an der University of California Davis. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Nutzung der doppelt resonanten kohärenten anti-Stokes-Raman-Streuung, um chemisch spezifische Bilder von Zellen zu erzeugen. Wir verwenden dieses Verfahren, um Signale von Molekülen nachzuweisen, die zu schwach sind, um allein durch die kohärente anti-Stokes-Raman-Spektroskopie direkt detektiert zu werden.Beginnen wir damit, Autos und Dr.-Autos-Signale gleichzeitig zu erzeugen. Dazu werden drei abstimmbare und synchronisierte Kurzpulslaserquellen benötigt, um diese synchronisierten Pulse zu erhalten. Beginnen Sie mit einem einzelnen Kurzpulslaser mit einer Ausgangsleistung von 10 Watt, einer festen Wellenlänge von 1064 Nanometern, einer festen Pulslänge von sieben Pikosekunden und einer festen Wiederholrate von 76 Megahertz.Mithilfe einer Reihe von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteilerwürfeln wird der Strahl in drei Teile aufgeteilt. Eine Halbwellenplatte in Kombination mit einem polarisierenden Strahlteilerwürfel ermöglicht die Einstellung der Leistung in jeder Strahlkomponente, ohne deren Richtung zu verändern. Üblicherweise werden zwei Strahlen jeweils auf etwa 4,5 Watt eingestellt, während der dritte Strahl das verbleibende eine Watt enthält.Die beiden Hochleistungsstrahlen werden anschließend in zwei unabhängige optische parametrische Oszillatoren oder OPOs gelenkt. OPOs nutzen die Erzeugung unterschiedlicher Frequenzen, um ein Photon mit hoher Energie in zwei Photonen mit niedrigerer Energie und unterschiedlichen Wellenlängen umzuwandeln. Durch die Steuerung der Temperatur des zur Erzielung dieses Effekts verwendeten Kristalls können die Wellenlängen der resultierenden Photonen auf 0,1 Nanometer genau geregelt werden.Durch Frequenzverdopplung dieser Signale kann ein Laser mit einer festen Wellenlänge von 1064 Nanometern nun in einen Laserstrahl umgewandelt werden, der zwischen 780 Nanometern und 910 Nanometern abgestimmt werden kann, indem zwei separate OPOs mit derselben 1064-Nanometer-Quelle gepumpt werden. Es werden zwei unabhängig abstimmbare Laserquellen erhalten, die automatisch mit unserem ursprünglichen Pump-Laser synchronisiert sind. Der dritte Strahl des 1064-Nanometer-Pump-Lasers wird durch eine Kombination aus dielektrischen Spiegeln um die OPOs herumgelenkt, sodass alle drei Strahlen später wieder kombiniert werden können.Um kohärente Ramansignalphotonen effizient zu erzeugen, müssen die rekombinierten Pulse sowohl zeitlich als auch räumlich überlappen, da die OPOs Ringresonatoren enthalten, die es jedem Laserpuls ermöglichen, mehrfach durch den Kristall zu laufen. Der durch die OPOs gesendete Strahl legt dadurch eine zusätzliche Strecke zurück, was im Vergleich zum ursprünglichen Pumpstrahl zu einer erheblichen Verzögerung führt. Dieser Wegunterschied muss durch einen dritten Strahl ausgeglichen werden, indem zusätzliche Spiegel eingefügt werden, die diesen Strahl zwingen, dieselbe Distanz wie die beiden anderen zurückzulegen, bevor sie mithilfe von dichroitischen Spiegeln rekombiniert werden, um eine feine Justierung der Pfadlänge zu ermöglichen. Jeder Strahl wird durch justierbare Verzögerungsstufen geleitet, die eine Anpassung des zeitlichen Überlapps der verschiedenen Laserpulse erlauben.Ein weiterer Satz von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteilerwürfeln wird jedem Strahl hinzugefügt, um die Laserleistung jedes Strahls unabhängig voneinander einstellen zu können. Dichroitische Spiegel werden verwendet, um zunächst die Strahlen der beiden OPOs zu kombinieren, und anschließend muss beim 1064-Nanometer-Strahl darauf geachtet werden, dass die Strahlen räumlich exakt überlappen. Dies kann überprüft werden, indem die Überlappung der Strahlen innerhalb weniger Zentimeter vor dem dichroitischen Spiegel mit derjenigen in etwa einen Meter hinter dem dichroitischen Spiegel verglichen wird.Da die Exposition gegenüber Laserstrahlen mit hoher Durchschnittsleistung die Probe beschädigen kann, werden die drei kombinierten Strahlen durch einen elektrooptischen Modulator geleitet, der als Pulsauswahlgerät fungiert und die Einstellung der Wiederholrate der die Probe erreichenden Pulse – und damit der Durchschnittsleistung – ermöglicht. Die kombinierten Laserstrahlen werden anschließend in ein aufrechtes Mikroskop mit einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur oder NA eingekoppelt. Die enge Fokussierung, die durch das Objektiv mit hoher NA erzeugt wird, ermöglicht die effizienteste Erzeugung kohärenter Raman-Signale auf mikroskopischen Längenskalen.Das Objektiv des Mikroskops ist auf einer X-, Y-, Z-Piezo-Plattform montiert, die es ermöglicht, Bilder durch Rasterabtastung der Strahlen über die Probe zu gewinnen, ähnlich wie bei kommerziellen Strahlabtast- und konfokalen Mikroskopen. Nun sehen wir uns an, wie CARS- und D-R-F-W-M-Signale erzeugt werden: Die Wechselwirkung dreier kurzer Laserpulse an der Probe führt zur Erzeugung mehrerer Vier-Wellen-Mischungssignale, wie beispielsweise CARS aus verschiedenen Kombinationen zweier Laser sowie Dreifarb-CARS- und DR-CARS-Signale aus der Kombination aller drei Laser. Wenn die Signale in der Wellenlänge nahe beieinander liegen, kann es schwierig sein, sie zur Analyse voneinander zu trennen.Aus diesem Grund werden Signale in ein abbildendes Spektrometer geleitet, das ebenfalls als Monochromator oder Bandpassfilter fungiert, um Signale unterschiedlicher Wellenlängen räumlich zu trennen. Ein elektronisch betätigter Kippspiegel innerhalb des Spektrometers leitet im abgesenkten Zustand das Signal zu einer rückseitig belichteten, tiefdepletierten CCD-Kamera (charge coupled device), die spektroskopische Informationen über den gesamten Signalbereich liefert und es uns ermöglicht, die verschiedenen kohärenten Robin-Signale zu identifizieren und zu optimieren, um das zu bildende Signal auszuwählen. Drehen Sie einfach das Beugungsgitter innerhalb des Spektrometers mithilfe der vom Hersteller bereitgestellten Steuer- und Datenerfassungssoftware, um den gewünschten Peak auf der CCD-Kamera zu zentrieren.Danach die Position des Umlenkspiegels verändern, um das Signal auf einen zweiten Ausgangsport umzuleiten, an dem ein einzelner Photonenzähl-Avalanche-Fotodetektor (DDE) oder ein Fotodetektor (PD) angeschlossen ist. Rastern. Das Objektiv abtasten und anschließend die auf dem APD aufgezeichneten Signale verwenden, um mithilfe der Datenerfassungssoftware ein Bild zu erzeugen, indem die Photonenzählrate für jedes Pixel dargestellt wird. Dieses Abbildungsverfahren für jedes gewünschte kohärente Raman-Signal wiederholen, sodass die Signale während der Nachbearbeitung verglichen werden können.Jetzt sehen wir uns an, wie man eine Probe korrekt präpariert, um klare und reproduzierbare Bilder zu erhalten. Bei der Probenvorbereitung ist Vorsicht geboten. Proben werden typischerweise auf etwa 150 Mikrometer dicken Glasdeckgläsern präpariert.Diese Deckgläser sind dünn genug, um eine hochauflösende Bildgebung mit den hochnumerischen (NA) Wasser- oder Öl-Immersionobjektiven zu ermöglichen, die in diesen Experimenten verwendet werden. Um die Vorbereitung einer typischen Probe zu demonstrieren, bereiten wir etwa 20 Mikrometer dicke Schnitte von fixiertem Maus-Muskulaturgewebe auf einem Objektträger vor. Ein 20-Mikroliter-Tropfen einer fünf Mol schweren Glucoselösung wird der Probe hinzugefügt.Die deuterierte Glucoselösung liefert eine eindeutige und starke Raman-Hintergrundsignatur. Ein Glasdeckel wird auf die Probe gelegt und mit Nagellack fixiert, um Zellen und Kultur zu stabilisieren. Es können auch Kulturschalen mit Glasboden verwendet werden, die eine Bildgebung ermöglichen, ohne dass die Zellen von ihren Zellkulturschalen abgelöst werden müssen.Jetzt wollen wir uns ansehen, wie man die geeigneten Raman-Linien und -Peaks für Dr. Cars bestimmt. Um den Effekt der doppelt resonanten Verstärkung richtig auszunutzen, müssen die Raman-Spektren beider resonant verstärkter Substanzen bekannt sein. Typischerweise handelt es sich dabei um 2.845 cm⁻¹, die mit Lipiden assoziiert sind, und um 2.121 cm⁻¹ für die CD-Streckmode, die mit deuterierter Glukose verknüpft ist.Kohärente Ramanstreuung wird erreicht, wenn die Frequenzdifferenz zwischen zwei Lasern der Frequenz einer molekularen Schwingung entspricht. Indem ein OPO auf 817 Nanometer abgestimmt wird, untersucht es die 2.845 cm⁻¹ C-Schwingung in Kombination mit dem 1064-Nanometer-Laserstrahl; wird das andere OPO auf 868 Nanometer abgestimmt, so untersucht es die 2.121 cm⁻¹-Schwingung in Kombination mit dem 1064-Nanometer-Strahl. Im spektroskopischen Modus ermöglicht das CAR-Mikroskop die Beobachtung von drei kohärenten Ramansignalen von Interesse: ein CAR-Signal, das die CH-Streckenschwingung untersucht, ein CAR-Signal, das den CD-Streckmodus untersucht, und ein DR-CAR-Signal, das beide untersucht. In dem hier gezeigten Diagramm zeigen gestrichelte Pfeile Photonen von den Lasern in den OPOs und durchgezogene Pfeile das resultierende Signal.Die durchgezogenen horizontalen Linien zeigen die Energie der Ramen-Schwingung an und veranschaulichen, dass bei DR-Autos gleichzeitiges Mischen derselben drei Eingangsphotonen zwei verschiedene Ramen-Schwingungen untersucht. Die Signalamplitude jedes Peaks muss durch Feinabstimmung in der Umgebung dieser Peak-Positionen optimiert werden. Hier wählen wir jeden Peak aus und nehmen Bilder von See-Elgan-Würmern in einer Lösung aus abgeschwächtem Glukose auf; die Gewinnung zusätzlicher Informationen basierend auf diesen drei separat aufgenommenen Bildern erfordert eine relativ einfache Bildverarbeitung.Zunächst müssen die Bilder normalisiert werden. Eine praktische Methode zur Normalisierung beruht auf der Tatsache, dass Lipide hydrophob sind. Dies bedeutet, dass in Bereichen mit hoher Lipiddichte der CD-Resonanzbeitrag der Glukose zum doppelt resonanten Signal nur gering sein sollte.Umgekehrt sollten in Bereichen mit reiner Glucoselösung die CH-Resonanzen der Lipide ebenfalls nur geringfügig beitragen. Vor diesem Hintergrund normieren Sie das DR-car-Bild und das auf der CD-Resonanz der deuterierten Glucoselösung erhaltene car-Bild auf einen Bereich deutlich außerhalb des CL-egan-Wurms, der keine CH-Resonanz aufweisen sollte. Identifizieren Sie anschließend einen Bereich innerhalb des Wurms im CH-resonanten car-Bild, der reich an Lipiden ist, und normieren Sie diesen auf den entsprechenden Bereich innerhalb des normalisierten DR-car-Bildes.Um sicherzustellen, dass diese Methode korrekt funktioniert, wird vorausgesetzt, dass in tieferen Bereichen dieser Region kein deuteriertes Glukose vorhanden ist. Diese Annahme ist gerechtfertigt, da die Lipide hydrophob sind und sich nicht mit der Lösung mischen werden. Indem nun das normalisierte CH-Resonanz-CAR-Bild vom normalisierten DR-CAR-Bild subtrahiert wird, verbleibt lediglich das verstärkte CD-Resonanzsignal, analog dazu durch Subtraktion des normalisierten CD-Resonanz-CAR-Bildes vom normalisierten Dr.FWM-Bild.Nur das verstärkte CH-Resonanzsignal bleibt übrig. Hier ist das Raman-Spektrum für eine modifizierte Ölsäure, die eine Alkin-Modifikation enthält: Die starken CH-Resonanzen bei 2.845 cm⁻¹ und die Alkin-Resonanz bei 2.121 cm⁻¹ sind beide gut vom Fingerabdruckbereich isoliert, also dem Bereich mit dicht gepackten Peaks, wodurch sie ideale Marker für die kohärente Raman-Bildgebung darstellen. Dies ist ein typisches Spektrum kohärenter Raman-Signale, die entstehen, wenn drei Kurzpulslaser im Probeninneren überlappen. Die Pfeile zeigen auf die Prozesse, die für jedes Signal verantwortlich sind, wie sie durch Energiediagramme dargestellt werden.Dies sind typische Ergebnisse der Bildgebung von C. Elgin's Würmern mittels DR-Autos und Autos. Die obere Zeile verwendete die zuvor gezeigten drei Signale, um einen Wurm in einer Lösung mit reduziertem Glukosegehalt abzubilden. In der zweiten Zeile wurden die Bilder entsprechend normalisiert, und in der dritten Zeile wurden Differenzbilder erzeugt, indem jeweils die Bilder des Autos von den Bildern des DR-Autos subtrahiert wurden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Raman-Differenzbildgebung basierend auf der doppelt resonanten kohärenten anti-Stokes-Raman-Mikroskopie durchführt.Beachten Sie bei diesem Verfahren, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass die Strahlen richtig überlappen und synchronisiert sind. Außerdem sollten Sie beim Wechsel zwischen verschiedenen kohärenten Signalen darauf achten, die Probe nicht zu stoßen oder zu bewegen, da dies die Analyse beeinflussen würde. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biologie

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