Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB
12. August 2010
Toxoplasma gondii verwandelt sich in eine Zyste bilden als Reaktion auf Belastungen der Umwelt, die in Gewebekultur-Modellen nachgeahmt werden kann. Dieses Video zeigt Techniken, um Zystenwand Bildung durch Aktivierung des Knochenmarks-Makrophagen oder Ändern Wachstumsmedium pH in Fibroblasten-Zellen zu untersuchen.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zystenwandbildung in Toxoplasma gondii in vitro zu induzieren und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zuerst Makrophagen und Fibroblasten kultiviert werden.
Und anschließend können durch Infektion dieser Wirtszellen unter Stressbedingungen durch pH-Schock von Fibroblasten oder Aktivierung der Makrophagen, beides führt zur Zystenwandbildung, Stressreaktionen des Parasiten in der Zelle induziert werden. Schließlich wird fluoreszierend markiertes Lektin zu den Kulturen hinzugefügt, das an die Zystenwand bindet, sodass die Zysten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können. Hallo, ich bin Crystal Tobin aus dem Labor von Dr. Laura Noel am Department für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der University of Wisconsin Madison.
Ich bin Angela Pollard, ebenfalls vom No Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur in-vitro-Bildung der Zystenwand von Toxoplasma gondii. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Reaktionen des Parasiten auf Stressbedingungen zu untersuchen.
Beginnen wir. Legen Sie eine sterile, runde Glasdeckenscheibe auf den Boden jedes Wells einer 24-Well-Gewebekulturplatte, um die Umwandlung von Toxoplasma gondii in Bradyzoiten in menschlichen Hautfibroblasten aus der Vorhaut unter Bedingungen eines hohen pH-Werts und Kohlendioxid-Mangels zu induzieren. Beginnen Sie mit einem konfluenten 150 cm²-Fläschchen menschlicher Vorhautfibroblasten unter einer Gewebekulturschutzhaube.
Spülen Sie den konfluenten Kolben mit menschlichen Fibroblasten aus der Vorhaut zwei Mal mit einem XPBS und geben Sie dann 2,5 Milliliter 0,025 % Trisphin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Nach der fünf- bis zehnminütigen Inkubation klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Oberfläche des Kunststoffs zu lösen.
Fügen Sie anschließend 150 Milliliter HFF-Medium oder ergänztes Delcos-modifiziertes Eagles-Medium hinzu und verwenden Sie das Medium, um den Kolben auszuwaschen und die Zellen zu sammeln. Geben Sie je ein Milliliter Zellen in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte mit Deckgläsern und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid Konfluenz erreichen.
Die Zellen sind dann bereit, mit dem Toxoplasma-Gondii-Parasiten infiziert zu werden. Unter dem Zellkulturhauben infizieren Sie einen 25 cm²-Fläschchen mit konfluenten humanen Vorderhautfibroblasten mit zwei mal 10⁶ Parasiten und inkubieren bei 37 °C, bis die Zellen beginnen, abzusterben. Nach etwa zwei bis drei Tagen verwenden Sie einen Zellabstreifer, um die infizierte Fibroblasten-Monoschicht aus dem Zellkulturfläschchen zu entfernen.
Anschließend lösen Sie die Parasiten aus den Wirtszellen, indem Sie die gelöste Zellschicht durch eine 27-Gauge-Nadel pipettieren. Bestimmen Sie mit einem Hämocytometer die Anzahl der Parasiten im Medium und infizieren Sie jeweils 10 hoch 5 Parasiten in jede der 24 Vertiefungen mit konfluenten humanen Hautfibroblasten aus der Vorhaut. Zuvor vorbereitet.
Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, damit die Parasiten in die Wirtszellen eindringen können. Fahren Sie fort, indem Sie die Umwandlung der Parasiten in das Brady-Zeolith-Stadium induzieren. Entfernen Sie das DMEM von den infizierten humanen Penisvorhaut-Fibroblasten.
Spülen Sie sie mit einem XPBS und geben Sie dann ein Milliliter Entwicklungsmedium hinzu. Ein auf RPMI basierendes Medium ohne Bicarbonat, das auf pH 8 eingestellt ist. Inkubieren Sie die Zellen drei Tage bei 37 Grad Celsius in Umgebungsluft.
Die Zellen können nun auf das Vorhandensein von Brady-zos analysiert werden. Das Vorhandensein von Brady ZOS wird mithilfe des fluoreszenzmarkierten Lektins Docos durch fluoreszierendes Glutenin oder DBA bestimmt, das an die Toxoplasma Gandhi ist-Assist-Wand bindet, um die infizierten Zellen für die fluoreszenzmikroskopische Bildgebung vorzubereiten. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit einem XPBS.
Anschließend fixieren Sie die Zellmonolagen mit 200 µL 3 % Formaldehyd für 20 Minuten. Entfernen Sie das Fixativ und spülen die Vertiefungen einmal mit XPBS. Geben Sie 200 µL 0,1 molarer Glycinlösung in die Vertiefungen und lassen Sie sie fünf Minuten lang stehen.
Entfernen Sie das Glycin und waschen Sie die Vertiefungen mit einem Mal XPBS, um die Zellen zu blockieren und zu permeabilisieren. Geben Sie 250 Mikroliter Blockierungslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang.
Entfernen Sie die Blockierungslösung und spülen Sie die Vertiefungen mit einem XPBS. Geben Sie 50 Mikroliter einer 1:250-Verdünnung von DBA, das an Rumine konjugiert wurde, in die Vertiefungen. Decken Sie die Platte ab und schütteln Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler.
Nach der Inkubation entfernen Sie das fluoreszenzmarkierte DBA durch dreimaliges Waschen der Deckgläser mit 0,2 % Triton X-100 in 1× PBS jeweils fünf Minuten lang auf einem Plattenschüttler und bringen Sie die Deckgläser schließlich mit einem Beta-Schild-Montagemedium, das dpi enthält, auf. Die Färbung T Gandhi kann mit einem Fluoreszenzmikroskop und einem für Rot-Dominanz geeigneten Filter bei einer 100×-Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Als alternative Methode zur Induktion der Brady-ZO-Bildung können infizierte, aus Knochenmark stammende Makrophagen mit Interferon-Gamma und Lipopolysaccharid oder LPS aktiviert werden. Beginnen Sie zunächst mit der Herstellung von L-929-konditioniertem Medium für diesen Prozess.
L 9 29 ist eine Spiegellinie einer angewandten Fibrosarkomzelllinie, die nach langen Phasen der Konfluenz makrophagenkoloniestimulierenden Faktor sezerniert. Dieses konditionierte Medium kann verwendet werden, um Maus-Knochenmarkzellen in der Zellkultur zu Makrophagen zu differenzieren. Um konditioniertes Medium herzustellen, kultivieren Sie 1 150 cm²-Flasche mit L 9 2 9-Zellen bis zur Konfluenz bei 37 °C. Anschließend inkubieren Sie die Zellen für weitere sieben bis neun Tage, bis sie kugelförmig erscheinen und sich von der Flaschenoberfläche abheben.
Sammlen Sie das Medium und alle abgelösten Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 420 ×g. Das resultierende Überstand ist das konditionierte Medium; ein 150 cm²-Fläschchen mit L 9 29-Zellen ergibt 30 Milliliter konditioniertes Medium, was dem Volumen entspricht, das zur Herstellung von 150 Milliliter BMC-Medium benötigt wird. Denken Sie daran, DMEM für BMC mit dem L 9 29-Zellkulturfläschchen vorzubereiten, das für die BMC-Entwicklung verwendet werden soll.
Um detaillierte Videoprotokolle zur Methode der Isolierung von Knochenmarkzellen anzusehen. Für die Mausfemuransammlung sehen Sie sich bitte die folgenden Videoprotokolle an, nachdem die gewonnenen BMCs fünf Tage lang inkubiert wurden. Geben Sie in bakteriologischen Petrischalen jeweils 10 Milliliter BMC-Medium zu, das konditioniertes Medium von L 9 2 9-Zellen enthält, und inkubieren Sie weitere zwei Tage, woraufhin sich die Zellen vollständig entwickelt haben.
Reife aus dem Knochenmark stammende Makrophagen oder BMS können ein bis zwei Wochen lang weitergeimpft werden. Um die BMS zu teilen, entfernen Sie das Medium und geben Sie fünf Milliliter kalte 1x PBS hinzu, die 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert werden, bis die Zellen beginnen, sich vom Untergrund zu lösen. Spülen Sie die Zellen mit einer sterilen Transferpipette von der Platte ab. Sammeln Sie die BMS in einem 50-Milliliter-Konischgefäß und pelletieren Sie die Zellen bei 420 × g für 10 Minuten.
Suspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter BMC-Medium und bestimmen Sie mithilfe eines Hämozytometers die Zelldichte. Ansäen Sie zwei mal 10 hoch fünf BMS pro Vertiefung in einer 24-Loch-Platte, die runde Deckgläser auf dem Boden enthält. Lassen Sie die Zellen über Nacht ankleben, bevor Sie sie mit T. gandhi infizieren.
Überschüssige Zellen können auf Petrischalen für eine spätere Verwendung zurückgestellt werden. Um die BMS zu aktivieren, bereiten Sie das Aktivierungsmedium vor, indem Sie LPS zwei Minuten lang in einem Wasserbad beschallen, um eventuelle Aggregate aufzulösen. Geben Sie dann dem BMC-Medium 100 Nanogramm pro Milliliter LPS und 100 Einheiten pro Milliliter IFN-gamma hinzu.
Entfernen Sie abschließend das BMC-Medium aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch eines der Aktivierungsmedien. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für drei Tage. BMCs können wie zuvor mit Fibroblasten aus der Vorhaut gezeigt angefärbt werden.
In diesen Beispielen sind Toxoplasma gondii Bradyzoiten mit fluoreszierendem DBA in menschlichen Penisvorhautfibroblasten markiert. Unter pH-Stress. Die Zystenwand ist fluoreszenzmarkiert, wie in diesem Querschnitt einer in vitro-Zyste in DMS gezeigt, die mit IFN-Gamma und L-P-S-D-V-A aktiviert wurden.
Die Färbung ist auch wie hier auf der Oberfläche des Vakuols sichtbar. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Toxoplasma gondii-Zysten in vitro in Fibroblasten und aktivierten Makrophagen anfärbt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Parasiten und Wirtszellen am selben Tag bereit sind.
Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video demonstriert Techniken zur Induktion und Visualisierung der Zystenwandbildung in Toxoplasma gondii unter Verwendung von Makrophagen und Fibroblasten. Die Studie konzentriert sich darauf, wie Umweltstressfaktoren die Zystenbildung auslösen können, was mittels Immunfluoreszenzmikroskopie beobachtet werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Toxoplasma gondii kann Zysten als Reaktion auf Umweltstress bilden.
- Die Zystenbildung kann mittels Gewebekultivierungstechniken in vitro modelliert werden.
- Immunzellen und Fibroblasten dienen als Wirtszellen für den Parasiten.
- Fluoreszierende Lektine werden zur Visualisierung der Zystenwände verwendet.
Zweck der Studie
- Induktion der Zystenwandbildung bei Toxoplasma gondii.
- Visualisierung der Zysten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Verständnis der Stressantworten des Parasiten in Wirtszellen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von Makrophagen und Fibroblastenzellen aus Knochenmark.
- Infektion von Wirtszellen mit Toxoplasma gondii.
- Induktion von Stressantworten durch Änderung des pH-Werts oder Aktivierung von Makrophagen.
- Anwendung fluoreszierender Lektine zur Visualisierung der Zystenwände.
Hauptergebnisse
- Die Zystenwandbildung wurde erfolgreich in vitro induziert.
- Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie war eine klare Visualisierung der Zysten möglich.
- Sowohl die pH-Veränderung als auch die Makrophagenaktivierung führten zur Zystenbildung.
- Die vorgestellten Techniken können auf weitere Studien zu Toxoplasma gondii angewandt werden.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert eine zuverlässige Methode zur Induktion und Visualisierung von Zysten.
- Das Verständnis der Zystenbildung kann zur Erforschung der Biologie von Toxoplasma gondii beitragen.
- Diese Techniken können für zukünftige Untersuchungen zu Wirt-Parasit-Interaktionen nützlich sein.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die mechanistische Absicherung der Bradyzoiten-Umwandlung von Toxoplasma gondii, ein entscheidender Schritt zum Verständnis chronischer Infektionen und des Reaktivierungsrisikos. Durch die Modellierung stressinduzierter Zystenbildung in vitro können Forscher die Wirkung von Substanzen auf Parasitenpersistenzwege bewerten. Der Ansatz unterstützt die Zielvalidierung und phänotypische Bildschirmung in der frühen Entdeckung antiparasitärer Interventionen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen zu Parasiten-Stressantwortwegen, die die Differenzierung von Tachyzoiten in Bradyzoiten steuern.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System, um Zielstrukturen, die an der Zystenwandbildung und Parasitenpersistenz beteiligt sind, funktionell zu validieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt krankheitsrelevante Bradyzoitenformen mit quantifizierbaren Zystenwandmarkern für die Bereitschaft zu Assays.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, fluoreszenzbasierte Screening-Verfahren für Verbindungen, die die Zystenbildung unter kontrollierten pH- oder Immunaktivierungsbedingungen hemmen oder induzieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung präklinischer Modelle, indem in vitro Zystenbildung mit chronischen Infektionsphänotypen verknüpft wird, die für die Neuro- und Muskeltropismus relevant sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine biomarkerbasierte Beurteilung der Zystenlast als translationsrelevante Messgröße für die Wirksamkeit von Wirkstoffen in Modellen der Persistenz.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für Workflows vom frühen Screening bis zur Identifizierung von Leitsubstanzen und bietet eine phänotypische Testplattform für Wirkstoffe, die auf die Stadienkonversion des Parasiten abzielen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich Parasiten-Stresssignalwegen und die biologische Absicherung von Persistenzmechanismen.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays und quantitative fluoreszenzbasierte Auswertungen zur zuverlässigen Beurteilung von Substanzen in 24-Well-Formaten.
- Analytik: Ermöglicht die Messung der Zystenwandbildung als abhängige Variable zum Vergleich unterschiedlicher Stressbedingungen oder Behandlungen mit Wirkstoffen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem sie die in zentralnervösem Gewebe und Muskelgewebe beobachtete Bradyzoitenbildung modelliert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der Entwicklungsstufenumwandlung apicomplexer Parasiten in verschiedenen Wirtszelltypen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der gezielten Beeinflussung von Parasiten-Differenzierungswegen und Verringerung mechanistischer Unklarheiten in Modellen chronischer Infektionen.
- Operationaler Wert: Standardisierung der Zysteninduktion und -visualisierung in Fibroblasten- und Makrophagensystemen verbessert die Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen durch Identifizierung von Substanzen, die die Bradyzoitenbildung modulieren, und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Stadien antiparasitärer Programme.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf deren Wirkung auf die Zystenwandbildung als Biomarker für Persistenz.
Durchführungsaspekte
- Es sind Kenntnisse in der Kultivierung von Parasiten, der Pflege von Wirtszellen und der Immunfluoreszenzmikroskopie erforderlich.
- Der Zugang zu einer Fluoreszenzmikroskopie mit geeigneten Filtern für die Rhodamin-Detektion ist unerlässlich.
- Die Standardisierung der IFNγ- und LPS-Aktivierungsprotokolle gewährleistet Konsistenz in Makrophagen-basierten Experimenten.
- Die Anpassung an verschiedene Wirtszelllinien erfordert die Validierung der Zystenwand-Permeabilität und der Lektin-Zugänglichkeit.
- Die Kontrolle der Umweltbedingungen hinsichtlich CO2-Gehalt und pH-Wert ist entscheidend für eine reproduzierbare Induktion in Fibroblastensystemen.
