Name: Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die bakterielle Lieferung von RNAi-Effektoren mittels Transkingdom RNAi zur Überwindung von Multidrug-Resistenz in Krebszellen. Diese Methode nutzt E. coli für den effektiven shRNA-Transport.

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1) Bakterielle Lieferung von shRNAs <ol><li> Bevor Sie mit der Bakterienkultur, muss man LB-Medium und LB-Agar vorzubereiten. </li><li> Für die LB-Medium abwiegen Hefeextrakt (0,5% w / v), Bacto Trypton (1,0% w / v) und NaCl (0,6% w / v) gelöst und diese Komponenten in aqua bidest. Die vorbereiteten Lösungen müssen in einem Autoklaven sterilisiert werden und sind dann einsatzbereit. </li><li> Für LB-Agarplatten Bacto-Agar (1,5% w / v) muss an die LB-Medium früheren zur Sterilisation hinzugefügt werden. </li><li> Aufheizen LB-Agar in der Mikrowelle bis zur LB-Agar vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Lösung abkühlen, bis die Flasche leicht und ohne sich zu verbrennen berührt werden. Add Kanamycin (100 mg / ml) für die Auswahl der positiven Klone in weiteren Schritten. </li><li> Bereiten LB-Agar-Platten bei einer laminaren Strömung Bank (sterile Bedingungen) durch Pipettieren 20 ml des LB-Agar-Lösung in 10-cm Petrischalen. Lassen Sie die Platten abkühlen, bis die Flüssigkeit fest geworden ist. Die Platten sind jetzt einsatzbereit und kann bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> ShRNA-kodierende Expressionsvektoren sind in kompetente E. verwandelt coli ceq221 durch Hitzeschock mit der CaCl 2-Verfahren. </li><li> Platte der transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten mit 100 pg / ml Kanamycin, den Deckel schließen, verschließen Sie die Platten mit Parafilm und pflegen den Kopf bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Impfen bakterielle mini Kulturen mit positiven Klone durch Abnehmen gewachsenen Kolonien mit einem Zahnstocher. Übertragen Sie die Zähne in 7,0 ml frisches LB-Medium mit 100 mg / ml Kanamycin und pflegen bei 37 ° C über Nacht auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute zu pflücken. </li><li> Inoculate 100 ml frischem LB-Medium mit 100 mg / ml Kanamycin 1:100 mit dem über Nacht Mini-Kultur in einem 1 l-Erlenmeyerkolben, und bei 37 ° C über Nacht auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Seed 25 x 10 4; menschlichen Magen-Karzinom-Zellen (EPG85-257RDB) pro Well in 6 (Anzahl der ausgesäten Zellen hängt von der Geschwindigkeit des Zellwachstums der nach Zelllinie Konfluenz sollten ~ 70-80% 24 Stunden nach der Aussaat werden) - auch Speisen und inkubieren diese bei 37 ° C, in einem 5% CO 2, Wasserdampf gesättigten Atmosphäre über Nacht. </li><li> Zurück zur Krebszelle Infektion über Nacht Kulturen tk RNAi-Vektor-haltigen E. coli sind in einem Photometer die OD 600 zu bestimmen. Verdünnen Sie die bakterielle Lösung bis eine optische Dichte von 0,5 erreicht ist (OD 600 = 0,5 gleich 1,6 x 10 8 Bakterienzellen / ml). </li><li> Ersetzen Sie die FCS-haltigen Zellkulturmedium der Karzinom-Zellen gegen FCS-freiem Medium 30 min früheren bakterielle Co-Inkubation. </li><li> Wash Bakterien zweimal mit 1 x PBS, und verdünnen in serum-freien Leibovitz L-15-Medium. </li><li> Add verdünnt Bakterien, Krebszellen in der gewünschten MOI (Multiplizität der Infektion = Anzahl der Bakterienzellen pro Krebszelle) und Co-Inkubation von Bakterien und Krebszellen für 2 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Nach 2 Stunden Co-Inkubation Krebszellen wurden zweimal mit 1x x PBS gewaschen und einmal mit serumhaltigem Leibovitz L-15-Medium mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2,5 pg / ml Amphotericin, 150 ug / ergänzt ml Gentamicin und 100 ug / ml Kanamycin. </li><li> Weiter pflegen die Krebszellen bei 37 ° C in einer 5% CO 2, Wasserdampf gesättigten Atmosphäre. </li><li> Die Auswirkungen der bakteriellen Behandlung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, durch quantitative real-time RT-PCR auf mRNA-Ebene gemessen und mittels Western-Blot-Analyse auf Protein-Ebene sichtbar gemacht und gezeigt, mit funktionellen Assays wie FACS-Analyse und Zellproliferationsassays. (Falls gewünscht, können diese Verfahren im Detail beschrieben werden). </li></ol> 2) repräsentative Ergebnisse Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollten die Ergebnisse vergleichbar sein, die nachfolgend dargestellt ist. Fluoreszenzmikroskopie Abbildung 1 zeigt einen menschlichen Magenkarzinom Zelle drei Stunden nach der bakteriellen Behandlung (a) im Vergleich zu einer unbehandelten Zellen (b). Rund um den Kern der behandelten Zelle, können Bakterien nachgewiesen werden. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Fluoreszenz-Mikroskopie menschlichen Magenkarzinom Zelle nach der bakteriellen Behandlung (1:500) und einer unbehandelten menschlichen Magenkarzinom Zelle als Steuer-, DAPI-Färbung, DAPI Bandpassfilter (Λem = 640 nm), 40x. Quantitative real-time RT-PCR In Abbildung 2 kann eine Down-Regulation der MDR1 mRNA von ca. 70% (schwarzer Balken) nach der Behandlung mit dem therapeutischen Bakterien gesehen werden. Parental-Zellen dienen als positive Kontrolle durch das Fehlen von MDR1-Überexpression. Die Zelllinie 257RDB P170 mit einem Plasmid, das anti-MDR1 shRNAs s als direkter Vergleich der transkingdom RNAi-Technologie mit anderen R genommenNAi silencing Strategien. Die unbehandelten resistent Zelllinie EPG85-257RDB überexprimierenden MDR1, die gleiche Zelllinie mit Bakterien ohne die shRNA exprimierenden Plasmid behandelt, und diese Zelllinie behandelt mit therapeutischen Bakterien, die ein Plasmid Ausdruck anti-MRP2 shRNAs wurden als positive Kontrollen. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Quantitative real-time RT-PCR MDR1 mRNA-Expression nach Behandlung mit therapeutischen E. coli ceq221 Ausdruck anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Die Normalisierung erfolgte mit dem Housekeeping-Gen Aldolase. Die MDR1/aldolase Verhältnis von unbehandelten Zellen der Zelllinie EPG85-257RDB wurden 100% gesetzt. P-Werte wurden mit dem Student-t-Test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Western-Blot-Analyse Abbildung 3 zeigt, dass die MDR1 Downregulation erfolgte auch auf Protein-Ebene nach der bakteriellen Behandlung. Es zeigt die fehlende MDR1 Expression des Medikaments sensible Eltern Zelllinie (EPG85-257P), die MDR1 Expression der unbehandelten resistente Zelllinie (EPG85-257RDB) und der MDR1 Expression der behandelten Probe. Eine klare Down-Regulation der MDR1 der bakteriell behandelten Zellen beobachtet werden kann. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Western-Blot-Analyse MDR1 Expression der unbehandelten Droge-sensitive EPG85-257P, das unbehandelte resistenten EPG-257RDB und der EPG85-257RDB nach Ko-Inkubation mit E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Primäre Ab C219 1:100 und anti-Aktin 1:5 000, sekundäre Ab-Anti-Maus 1:10 000. Zytotoxizitätsassay Funktionelle Analyse wie die Zytotoxizitätsassay in Abbildung 4 dargestellt sind auch Indikatoren für das Funktionieren des transkingdom RNAi. Die elterliche Zelllinie und der Zell-Linie, die eine anit-MDR1 shRNA exprimierenden Plasmid zeigen keine Resistenz gegenüber Daunorubicin. Die resistenten Zelllinie EPG85-257RDB und zwei weitere Kontrollen keine signifikanten Änderungen des Widerstandes im Vergleich zu der Probe mit anti-MDR1 shRNA exprimierenden Bakterien, wo der Widerstand gegen Daunorubicin um ca. 90% rückgängig gemacht werden könnte behandelt. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Zytotoxizitätsassay. Drug-spezifische IC50-Werte von einem Zytotoxizitätstest für das Überleben der Zelle bestimmt. P-Werte wurden mit dem Student-t-Test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Anthrazyklin Anhäufung Test Nach Angaben der Abwehrschwäche von bakteriell behandelten Proben (Abbildung 4) wird die Anthrazyklin Ansammlung von anti-MDR1 shRNA behandelten Zellen um etwa 90% erhöht, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die elterliche Zelllinie und die Zelllinie 257RDB P170 zeigen eine starke Daunorubicin Anhäufung von bis zu 100%. Die resistenten Variante zeigt nur selten eine Akkumulation. Zellen mit anti-MDR1 shRNA exprimierenden Bakterien behandelt zeigen eine Anthracyclin Anhäufung Steigerung von 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: Anthrazyklin Anhäufung Assay. Anthrazyklin Ansammlung von Karzinomzellen 6 Tage nach der bakteriellen Behandlung mittels Durchflusszytometrie gemessen. P-Werte wurden mit dem Student-t-Test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Die Zellzahl für eine Infektion ausgesät und die entsprechenden MOI verwendet, sich kritisch mit den Zelllinien unter Beobachtung und deren Geschwindigkeit des Wachstums ab. Um eine optimale Zellzahl für die Aussaat sind pre-Experimente, um die Geschwindigkeit des Wachstums bestimmen dringend empfohlen. Daneben sollten verschiedene MOIs aufgrund der begrenzten getestet werden zu verlängern, um die Zellen können die bakterielle Invasion, ohne zu sterben von Stress stehen. Der optimale Zeitpunkt, wo die Down-Regulation de...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung – PBS (10×)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Kein Katalog verfügbar, direkte Bestellung</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>Enthält 5.000 Einheiten Penicillin (Base) und 5.000 &amp;mu;g Streptomycin (Base)/ml, hergestellt aus Penicillin G (Natriumsalz) und Streptomycinsulfat in 0,85 %iger Kochsalzlösung.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

bakterielle lieferung von rnai effektoren: transkingdom rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein hoch wirksamer Mechanismus für die spezifische Hemmung der mRNA-Expression. Neben ihr Potenzial als ein leistungsfähiges Labor-Tool, erscheint der RNAi für therapeutische Nutzung vielversprechend. Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, die Lieferung von RNAi-vermittelnde Agenten an Zielzellen ist eine der größten Hindernisse. Eine neuartige Strategie, diese Hürde zu überwinden, ist transkingdom RNAi (tk RNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogene Bakterien, z. B. Escherichia coli, zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen zu RNAi zu induzieren. Eine der ersten Generation tk RNAi-vermittelnde Vektor, TRIP, enthält die Bakteriophagen T7 Promotor für die Expression Regulation eines therapeutischen shRNA von Interesse. Darüber hinaus hat die TRIP Inv locus von Yersinia pseudotuberculosis, dass Invasin kodiert, die natürliche invasive Bakterien erlaubt, β1-Integrin-positiven Säugetierzellen und die HlyA Gen aus Listeria monocytogenes, die Listeriolysin O. Dieses Enzym produziert eingeben kann die therapeutische shRNA zu entkommen Eintrag Vesikel im Zytoplasma der Zielzelle. TRIP-Konstrukte sind zu einem kompetenten nicht-pathogene Escherichia coli-Stamm, der T7-RNA-Polymerase, die für die T7-Promotor-gesteuerte Synthese von shRNAs kodiert eingeführt. Ein gut charakterisierter Krebs-assoziierte Zielmolekül für unterschiedliche RNAi-Strategien ist ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Das ABC-Transporter fungiert als eine Droge Extrusionspumpe und vermittelt die &quot;klassische&quot; ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) Phänotyp von menschlichen Krebszellen, die durch eine spezifische Kreuzresistenz Muster geprägt ist. Verschiedene ABCB1-exprimierende MDR Krebszellen wurden mit anti-ABCB1 shRNA Expressionsvektor trägt E. behandelt coli. Dieses Verfahren führte zu einer Aktivierung der RNAi Wege innerhalb der Krebszellen und eine beträchtliche Down-Regulation der ABCB1 codierenden mRNA sowie den entsprechenden Medikamenten Extrusionspumpe. Dementsprechend wurde Kumulation in der unberührten resistente Krebszellen verbessert und die MDR Phänotyp wurde rückgängig gemacht. Durch dieses Modell die Daten liefern die Proof-of-concept, dass tk RNAi geeignet für die Modulation von Krebs-assoziierte Faktoren, z. B. ABCB1, in menschlichen Krebszellen ist.

Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, wurde eine neue Strategie entwickelt, transkingdom RNAi (tkRNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogenen Bakterien zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen. Hier wurde tkRNAi erfolgreich Umkehrung der klassischen ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) von Krebszellen eingesetzt.

Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

Die RNA-Interferenz (RNAi) stellt einen hocheffektiven Mechanismus zur spezifischen Hemmung der mRNA-Expression dar. Neben ihrem Potenzial als leistungsstarkes Laborwerkzeug ...

Im trans-kingdom-RNA-Interferenz- oder RNAi-Verfahren werden Bakterien verwendet, um kurze Haarnadel-RNAs oder gegen das Gen der Interesse MDR1 in diesem Protokoll gerichtete RNAs in Krebszellen einzuschleusen, um das Gen der Interesse durch RNAi zu stillen. Zunächst werden Escherichia-coli-Bakterien mit einem SH-RNA-exprimierenden Vektor transformiert. Anschließend werden Beta-1-positive Krebszellen ausgesät, sodass die Konfluenz 24 Stunden nach der Aussaat 70 % bis 80 % beträgt. Im nächsten Schritt werden die SH-RNA-exprimierenden Bakterien und die Zellen zwei Stunden lang gemeinsam inkubiert.Schließlich wird die Co-Inkubation durch eine antibiotische Behandlung der Krebszellen beendet. Die Ergebnisse zeigen eine Herunterregulation des Gens der Interesse auf mRNA-, Protein- und funktioneller Ebene mittels Echtzeit-PCR, Western-Blot-Analyse, Zellproliferationsassays und Medikamentenakkumulationsassays. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Standardverfahren wie der S-I-R-N-A-Transfektion unter Verwendung von Oligo-Effekt-Mittel liegt in der effektiven und direkten Abgabe von irna in die Zielzellen.Die Trans-Königreich-RNAi, oder TK-RNAi-Technologie, nutzt nicht-pathogene EIA-coli-Stämme, um therapeutische kurze Haarnadel-RNA oder HRNA in Zielzellen zu produzieren und abzugeben, um so die RNAi auszulösen. Ein Vektor der ersten Generation zur Vermittlung der TK-RNAi, oder Trip, enthält den Bakteriophagen-T7-Promotor zur expressionsregulierenden Kontrolle einer therapeutischen SH-RNA von Interesse. Außerdem enthält Trip das INV-Locus von Yersinia pseudotuberculosis, das für Invasin kodiert und es natürlicherweise nicht-invasiven Bakterien ermöglicht, in β1-Integrin-positive Säugetierzellen einzudringen.Tripp enthält außerdem das hli-Gen aus Listeria monocytogenes, das Listeriolysin O produziert. Dieses Enzym ermöglicht es der therapeutischen hRNA, aus Eintrittsvesikeln im Zytoplasma der Zielzelle zu entkommen. Trop-Konstrukte werden in einen kompetenten, nicht-pathogenen Escherichia-coli-Stamm eingeführt, der die für die T7-Promotor-gesteuerte Synthese von shRNAs notwendige T7-RNA-Polymerase kodiert. Die Bakterien und eukaryotischen Zellen werden gemeinsam inkubiert, wodurch die Bakterien in die eukaryotischen Zellen eindringen können.Die SH-RNAs werden freigesetzt und gelangen in einen RNAi-Weg. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie am Tag zuvor eine Kultur von E. coli-Bakterien ansetzen, die mit dem S-H-R-N-A-exprimierenden Trip-Faktor transformiert wurden, wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Bakterien mit den Zielzellen, indem Sie 25 mal 10 hoch vier humane Magenkarzinomzellen pro Vertiefung in Sechs-Loch-Platten ansäen.Die Anzahl der ausgesäten Zellen hängt von der Wachstumsgeschwindigkeit der Zelllinie ab; planen Sie den Aussaatzeitpunkt so, dass die Konfluenz etwa 70 bis 80 % nach 24 Stunden beträgt. Inkubieren Sie die ausgesäten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Messen Sie vor Beginn der Krebszellinfektion die optische Dichte der Übernachtkulturen des e coli, das den TK-RNAi-Vektor enthält.Bestimmen Sie den OD 600, verdünnen Sie die Bakterienlösung auf eine optische Dichte von 0,5, 30 Minuten vor der bakteriellen Kokultivierung ersetzen Sie das Zellkulturmedium, das FCS enthält, durch FCS-freies Medium während des 30-Minuten-Zeitraums. Waschen Sie die Bakterien zweimal mit einmaligem PBS durch Zentrifugation bei 4.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie sie in serumfreiem Lab-VS.L 15, Medium auf das ursprüngliche verdünnte Volumen. Sobald die Bakterien resuspendiert sind und die Zellen ihre 30-minütige Inkubation abgeschlossen haben, die Bakterien den Krebszellen in der gewünschten Multiplizität der Infektion oder MRI hinzufügen, die im Bereich von eins zu 300 bis eins zu 700 liegen sollte. Bakterien und Krebszellen zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer mit 5 % Kohlendioxid gesättigten, wasserdampfgesättigten Atmosphäre gemeinsam inkubieren.Nach zweistündiger Co-Inkubation die Krebszellen zweimal mit 1× PBS und einmal mit serumhaltigem L-15-Medium waschen, das mit 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin, 100 Mikrogramm pro Liter Streptomycin und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter ergänzt ist.Amphotericin 150 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin und 100 Mikrogramm pro Milliliter. Kann Mycin die Krebszellen bei 37 Grad Celsius in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid weiterkultivieren? Die Wirkungen der bakteriellen Behandlung können mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, auf mRNA-Ebene durch quantitative Echtzeit-RT-PCR gemessen und mittels Western-Blot-Analyse untersucht werden.Funktionelle Assays wie die Fax-Analyse und Zellproliferationsassays können ebenfalls verwendet werden. Dieses repräsentative Bild wurde drei Stunden nach der Inkubation von humanen Magenkarzinomzellen mit Bakterien, die therapeutisch wirken, aufgenommen. S-H-R-N-A-Bakterien können um den Kern der behandelten Zelle herum nachgewiesen werden.In diesem Experiment wurde die Herunterregulation der Expression des Multidrug-resistenten Gens MDR1 mittels Echtzeit-PCR untersucht. Nach Behandlung mit einem therapeutischen Bakterium ist eine Herunterregulation von mdr1-mRNA um etwa 70 % erkennbar. Die Herunterregulation von MDR1 fand ebenfalls auf der Proteinebene nach bakterieller Behandlung statt.Die MDR1-Proteinspiegel nahmen im Zeitverlauf im Vergleich zur Kontrollzelllinie ab. Eine funktionelle Analyse basierend auf den Ergebnissen des hier gezeigten Zytotoxizitätsassays kann als Indikator für die Funktionsweise des trans-kingdom-RNAi dienen, während eine arzneimittelresistente Zelllinie nicht auf das Krebsmedikament anspricht. Nach Behandlung mit Downaubin zeigt dieselbe Zelllinie, die mit Bakterien infiziert wurde, die mit einem Plasmid transformiert worden waren, das eine anti-MDR1-s-h-r-N-a exprimiert, Empfindlichkeit gegenüber dem Medikament.Letztlich zeigte die krebsresistente Zelllinie in einem Anthrazyklin-Akkumulationsassay eine geringe Anreicherung des Krebsmedikaments, was bei den krebsresistenten Zellen beobachtet wurde, die mit dem MDR1-SHRNA behandelt worden waren. Diese Technik kann innerhalb von 28 Stunden angewendet werden, sofern sie ordnungsgemäß gemäß diesem Verfahren durchgeführt wird. Andere Techniken wie RT-PCR können angewendet werden, um verschiedene Fragen hinsichtlich der regulatorischen Effekte auf das Gen der Interesse zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man die trans-kingdom-RNA-Interferenz durch Co-Inkubation von HRNA-exprimierenden Bakterien mit besserer einer positiven, säugetierlichen Zelllinie anwendet.

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Forschung

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Biologie

RNA-Interferenz (RNAi) basierten Gen-Knockdown-Techniken sind der Kern der Tribolium Forschung. Hier geben wir einen Überblick über unsere Larven RNAi-Technik in Tribolium castaneum. Larven RNAi ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, die den schnellen Zugriff auf Verlust-Funktion Phänotypen bietet, so dass die Forscher Gen-Funktionen in verschiedenen Kontexten zu studieren.

Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum

Wir beschreiben eine Methode, um die Genexpression in einer wachsenden Population von E. coli-Zellen unter Verwendung sequenzgesteuerter sRNA-Expressionskassetten zu unterbinden, die von einem M13-Phagemid-Vektor abgegeben werden.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in<em&gt; E. coli</em

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

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Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

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Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

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Ein λ-Red-vermitteltes Rekombinationssystem wurde verwendet, um eine Deletionsmutante einer kleinen nicht-kodierenden RNA micC zu erzeugen.

Eine nicht-kodierende kleine RNA MicC trägt zur Virulenz von Proteinen der äußeren Membran in Salmonella enteritidis bei

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

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Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

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Lokalisierte RNAi und ektopische Genexpression in der Blutegel

Erfahren Sie die bakterielle Lieferung von RNAi-Effektoren mittels Transkingdom RNAi zur Überwindung von Multidrug-Resistenz in Krebszellen. Diese Methode nutzt E. coli für den effektiven shRNA-Transport.

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