In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Entwicklungseffekte von Knockdown oder Überexpression von Genen in bestimmten Untergruppen neuronaler Vorläuferzellen im Neokortex zu untersuchen. Dies wird durch in vivo Elektroporation von DNA in Rattenembryonen erreicht, um neokortikale Vorläuferzellen zu transfizieren. In einem zweiten Schritt wird der elektroporierte Bereich präpariert, um ihn für transfizierte Zellen anzureichern.

Anschließend werden diese Zellen dissoziiert und in Kammerobjektträgern plattiert und kultiviert. Um die Auswirkungen sowohl der intrinsischen genetischen Veränderung als auch der Anwendung exogener Faktoren zu untersuchen, wurden Ergebnisse erhalten, die Auswirkungen auf das Wachstum und die Verzweigung von Neuriten auf der Grundlage quantitativer Messungen mit der avision-Software zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen, wie z. B. der lipidbasierten Transfektion primärer neuronaler Kulturen, besteht darin, dass wir auf bestimmte Untergruppen neuronaler Vorläuferzellen abzielen können.

Zum Beispiel werden mit dieser Methode nur glutamaterge Neuronen transfiziert. Darüber hinaus können wir in früheren embryonalen Stadien Elektro beten und auf frühgeborene Neuronen in tieferen Schichten abzielen, oder wir können in späteren Entwicklungsstadien elektrolytieren und später geborene Neuronen anvisieren, die für oberflächlichere Schichten des Kortex bestimmt sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroentwicklung zu beantworten.

Wie interagieren zum Beispiel intrinsische und extrinsische Faktoren, um das Wachstum und die Verzweigung von Neuronen zu beeinflussen? Obwohl diese Methode Einblicke in das Wachstum neuronaler Prozesse geben kann, kann sie auch auf andere neurologische Entwicklungsprozesse wie Synaptogenese, Zellproliferation und Sulfatbestimmung angewendet werden. Bereiten Sie eine Injektionsnadel vor, wie im Begleittext beschrieben.

Um Blasen zu vermeiden, füllen Sie die Nadel mit DNA, die GFP exprimiert, und das Gen von Interesse enthält schnelles Grün. Um die Injektionen sichtbar zu machen, füllen Sie den verbleibenden Raum in der Nadel mit Maisöl. Befestigen Sie eine Pico-Schorle an der geladenen Nadel, um die Injektionen zu kontrollieren. Legen Sie die Gebärmutterhörner einer anästhesierten schwangeren Spray-Türratte frei, wie zuvor beschrieben.

Und im Begleittext zu diesem Video wird hier die Injektion von E 15-Embryonen gezeigt. Identifizieren Sie die Injektionsstelle, indem Sie die Embryonen mit einer Schwanenhalslampe beleuchten. Manipulieren Sie vorsichtig einen Embryo, um herauszufinden, wo sich der Kopf befindet, und lokalisieren Sie die Mittelliniennaht.

Verwenden Sie dies als Orientierungspunkt, um die Seitenkammer zu finden. Injizieren Sie DNA durch die Gebärmutterwand in den Seitenventrikel. Injizieren Sie mehrere Impulse in den Ventrikel, bis dieser mit DNA gefüllt ist.

Der Vektor, der durch die Platzierung der Elektroden bestimmt wird, ist entscheidend für die Bestimmung, welche Region des Neokortex elektroporiert wird. Hier wird die positive Elektrode in der Nähe der dorsalen medialen Positionen quer durch das Großhirn platziert, um auf diese Region des Vorderhirns abzuzielen. Eine alternative Platzierung der Elektroden zielt auf andere Regionen des Kortex ab, einschließlich des lateralen kortikalen Stroms.

Injizieren Sie jeden Embryo und elektroporieren Sie ihn. Bringen Sie wiederum die Gebärmutterhörner wieder in die Körperhöhle zurück und schließen Sie den Schnitt. Überwachen Sie die Tiere, während sie sich von der Narkose erholen.

Hier werden die Tiere 24 Stunden nach der Elektroporation für die Kultur geerntet, so dass GFP nachweisbar ist. Entnehmen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter der euthanasierten Ratte und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit eiskaltem HBSS mit zweiwertigem Kation in einer Lamina-Flow-Haube gefüllt ist. Und unter einem Fluoreszenzmikroskop verwenden Sie die Dumont-Pinzette Nummer fünf.

Um die Kortikale zu präparieren. Verwenden Sie eine Dumont-Pinzette der Größe Nummer drei, um die Hirnhäute zu entfernen, und schalten Sie die Fluoreszenz mit einer Valschere ein. Schneiden Sie die GFP-positiven Bereiche des Gewebes aus.

Füllen Sie diese Stücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit eiskaltem HBSS ohne zweiwertiges Kation gefüllt ist. Sammeln Sie alle GFP-positiven Teile in der Tube. Nehmen Sie das HBSS aus dem Röhrchen und ersetzen Sie es durch einen Milliliter 0,25%ige EDTA-Lösung, die fünf Minuten lang vorsichtig mit einem Inversionsinkubator bei 37 Grad Celsius gemischt wird.

Entfernen Sie die Tripsin-Lösung. Ersetzen Sie es durch zwischen einem und fünf Milliliter Beschichtungsmedium, je nach Menge an GFP-positivem Gewebe. Mit einer Zwei-Milliliter-Stripette-Pipette wurde fünf- bis siebenmal gegessen, um die Zellen zu dissoziieren.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, verdünnen Sie es mit Plattierungsmedium auf eine Konzentration von zwei bis 3,5 mal 10 auf die fünf Zellen pro 1,5 Milliliter der Mediumplatte, 1,5 Milliliter in jeder Kammer einer CC-Kammer mit zwei beschichteten Platten. Gleiten. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen an den Objektträgern haften können. Das Aspirat des Beschichtungsmediums enthielt 1,5 Milliliter neuronales Medium pro Kammerkultur.

Die Zellen werden bei 37 Grad Celsius auf das gewünschte Stadium gebracht, bevor sie mit der Immunfärbung fortfahren. Zur Messung des neuronalen Prozesses. Die Kultur des Auswuchszeitpunkts variiert zwischen 24 Stunden und sieben Tagen.

In einem Abzug wird das Medium aus jeder Kulturkammer abgesaugt. Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 4% Formaldehyd. Zweimal schnell waschen, einmal mit PBS, bevor Sie blockieren und immunisieren, wie in den Kulturen beschrieben, wie im Begleittext beschrieben, die Kulturen mit fluoreszierendem Eindeckmedium und einem Deckglas einbinden.

Visualisieren Sie die Kulturen bei 20 x unter einem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie Bilder von GFP-positiven Neuronen zur Analyse auf. Wir haben herausgefunden, dass mit dieser Technik etwa 75 % der elektroporierten Gehirne auf die gewünschte Region des Kortex abzielen, sei es der dorsale mediale Kortex oder der ventrale laterale Kortex.

Wir haben festgestellt, dass die frühe Elektroporation bei E 13 bis 14 auf Neuronen in der tiefen Schicht abzielt, wie z. B. TBR, eine positive Schicht, sechs Neuronen, während das spätere Elektroporationsziel, CT, IP, zwei positive TBR, eine negative Schicht, fünf Zellen, noch später, das Elektroporationsziel, BRN zwei positive Schichten, zwei Slash, drei Zellen anvisiert. Hier zeigen wir koronale Schnitte von Gehirnen, die entweder am 15.5. oder 17.5. embryonalen Tag elektroporiert und am fünften postnatalen Tag entnommen wurden. In Kultur kann der Prozentsatz der Zellen, die A GFP-positiv sind, stark variieren, je nachdem, wie konservativ Sie beim Präparieren der GFP-positiven Region vorgehen.

Aber selbst wenn wir sehr konservativ vorgehen und nur das GFP-positive Zellpflaster heraussezieren, liegt der höchste Prozentsatz, den wir beobachten, bei fünf bis 10 %. Diese niedrige Transfektionseffizienz ist hilfreich, um zu identifizieren, welche Prozesse zu der elektroporierten Zelle gehören, die Sie analysieren. Die Beschichtung von Zellen mit dieser höheren Dichte trägt zu gesünderen Kulturen bei. Es ist jedoch schwierig zu erkennen, welcher Prozess in den GFP-negativen Zellen zu welchem Zellkörper gehört.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Immunfärbung für mehrere verschiedene Marker durchgeführt werden, um Fragen zur Proliferation, Synaptogenese und Sulfatbestimmung zu beantworten. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sterile Reagenzien und Werkzeuge zu verwenden, um eine Kontamination und Infektion zu verhindern. Jeder Aspekt dieser Technik kann in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Das war's also. Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.