Doppelfärbemethode: Eine Technik zur Visualisierung von Pflanzen-Pilz-Wechselwirkungen unter Verwendung von Rutheniumrot und Lactophenol-Baumwollblau

Im Kaffeerost landen Sporen von Hemileia vastatrix – einem pathogenen Pilz – auf der Pflanzenoberfläche und bilden einen Keimschlauch heran, wodurch über die Hyphen eine Infektion eingeleitet wird.

Diese Hyphen breiten sich im Gewebe aus und dringen über spezialisierte fingerartige Strukturen, die Haustorien, in die Pflanzenzellen ein, die die Pflanzennährstoffe aufnehmen. Haustoria sezernieren auch Effektormoleküle, die von den Resistenzproteinen der Pflanze erkannt werden, was zu einer pektinreichen Verkapselung der Haustoria führt, um die Infektion einzudämmen.

Um diese Wechselwirkung zu visualisieren, beginnen Sie mit einem ultradünnen, in Harz eingebetteten, infizierten Kaffeeblattabschnitt. Behandeln Sie nun die Probe mit Lactophenol-Baumwollblau - einem histologischen Fleck aus Phenol, Milchsäure, Glycerin und Baumwollblau. Den Objektträger kurz erhitzen.

Wenn die Farbstoffkomponenten in das Gewebe eindringen, eliminiert das Phenol alle lebenden Organismen, während Milchsäure und Glycerin dazu beitragen, die Zellarchitektur zu erhalten. Gleichzeitig binden sich die Baumwollblau-Moleküle an die Chitin-Anteile in der Zellwand des Pilzes und färben sie blau.

Waschen Sie die Probe mit destilliertem Wasser. Behandeln Sie die Probe dann mit rutheniumrotem Farbstoff.

Die positiv geladenen Rutheniummoleküle binden an die negativ geladenen Polysaccharide in der pektinreichen pflanzlichen Zellwand und färben diese rot. Waschen Sie den Objektträger erneut und visualisieren Sie ihn unter einem Mikroskop.

Die pektinreiche pflanzliche Zellwand erscheint rot und umschließt die blauen Haustorien, die sich von den blauen Pilzhyphen erstrecken.