Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Unsere visuelle Erfahrung beginnt, wenn das Sehpigment in unseren retinalen Photorezeptoren Photonen der Lichtenergie absorbiert, was schließlich zum Verschluss zyklischer Nukleotid-gesteuerter Kanäle in der Zellmembran führt. Dadurch wird die Ausschüttung des Neurotransmitters Glutamat sowohl aus den Stäbchen als auch aus den Zapfen unterdrückt. Das freigesetzte Glutamat wird von nachgeschalteten Netzhautzellen wahrgenommen, um die nachgeschalteten Signale zu untersuchen.

Die Augen werden einer euthanasierten Maus entnommen. Die S werden isoliert, in einen Agarblock eingebettet und mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotoms in Scheiben geschnitten. Anschließend werden die Netzhautschnitte unter ein Mikroskop gelegt und mit LED-Beleuchtung stimuliert.

Während der Patch-Clamp-Aufzeichnung werden Aufzeichnungen gemacht, um die erzeugten synaptischen Ströme oder Potentiale zu messen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der zusätzlichen Komplexität der Arbeit im Dunkeln Schwierigkeiten haben. Die Möglichkeit, den gesamten Prozess zu visualisieren, vermittelt ein Gefühl, das sonst schwer zu beschreiben ist.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Aufzeichnungs- und Referenzdrahtelektroden, die verwendet werden, mit einer Schicht Silberchlorid beschichten. Tauchen Sie die Elektroden in ein molares Natriumchlorid. Dann treiben Sie mit einer 15-Volt-Stromquelle mit einer Ein-Hertz-Sinuswelle etwa 20 Sekunden lang 15 Volt zwischen ihnen an.

Bereiten Sie mit einem Mikropipettenabzieher Patch-Pipetten aus feuerpoliertem BO-Quarzglas vor und wählen Sie einen Pipettenspitzenwiderstand basierend auf der Größe der Zielzellen für Zellkörper mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern. Verwenden Sie für Zellkörper ein Rohr aus PET mit einem Spitzenwiderstand von fünf bis 10 Megaohm. Verwenden Sie nach einem Durchmesser von etwa fünf Mikrometern einen Spitzenwiderstand von 12 bis 15 Megaohm.

Um die geschliffenen Referenzelektroden vorzubereiten, verwenden Sie eine Spritze, um den Polyethylenschlauch mit einer 3,5%igen Agarlösung zu füllen, die in einem millimolaren Natriumchlorid hergestellt wurde. Bereiten Sie anschließend die folgenden Lösungen gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll vor. Externe Badlösung, Schnittlösung, Kaliumaspartatpipette, interne Lösung und die Agar-Rücklaufsperre.

Lagern Sie alle Lösungen bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Am Tag des Experiments nahm Thor etwa 1,5 Milliliter Kaliumaspartat in die innere Lösung. Fügen Sie dann verdünntes Fluor hinzu.

Gießen Sie ca. 50 Milliliter natriumbicarbonathaltiges AIMS-Medium in den lichtdichten Vorratsbehälter. Schließen Sie den Kunststoffschlauch an einen Gastank an, der 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff enthält, um das Zielmedium mit dem Gas auszugleichen, und stellen Sie den Behälter dann in ein 30 bis 32 Grad Celsius heißes Wasserbad. Füllen Sie dann eine Flasche mit 110 Millilitern Zielen, Medium mit den Erbsen und stellen Sie es auf Eis.

Setzen Sie das Medium gleich, indem Sie die Lösung mit 100%igem Sauerstoffgas sprudeln. Das restliche Natriumbicarbonat-haltige AIMES-Medium in ein beheiztes Reservoir auf dem Faradayschen Käfig geben. Wickeln Sie Paraform um den Schlauch und den Flaschendeckel, um das Gas im Raum über der Lösung einzuschließen und mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoffgas auszugleichen.

Bereiten Sie mit einem Glasluftdispersionsrohr 3% niedrige Geliertemperatur Aros vor, indem Sie 0,75 Gramm zu 25 Millilitern Aims Medium mit viel Hitze hinzufügen. Die Lösung ist unter Rühren etwa 115 Grad Celsius heiß. Wenn die Lösung klar und blasenfrei wird, geben Sie die geschmolzene Agarlösung in ein 42 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Richten Sie die Aufnahmekammer auf dem inversen Mikroskop ein. Schieben Sie eine fünf Zentimeter lange Agarbrücke über die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode und positionieren Sie sie in der Aufnahmekammer. Der Widerstand der Pipettenspitze kann gemessen werden, indem eine Pipette mit interner Lösung gefüllt, auf den Pipettenhalter gelegt, der Pipettenhalter in den Verstärkerkopftisch eingesetzt und die Pipette in die Lösung abgesenkt wird, um das Sehpigment für physiologische Aufzeichnungen zu erhalten. Alle Eingriffe sollten unter Infrarotlicht mit einer Infrarotbrille durchgeführt werden, aber alle Eingriffe werden hier bei Raumlicht gezeigt.

Nachdem die Maus eingeschläfert wurde, verwenden Sie eine gebogene Schere, um die Augen schnell zu entfernen. Lege die Augen auf ein Stück Filterpapier, damit sie nicht wegrollen. Halten Sie dann ein Auge mit einer Pinzette fest und bohren Sie mit einer dünnen doppelseitigen Klinge einen Schlitz in die Hornhaut.

Sobald der Augapfel punktiert ist. Übertragen Sie das Auge in eine 60 Millimeter große Petrischale, die mit Aims Medium gefüllt ist. Schneide den Schlitz in der Hornhaut als Eintrittspunkt aus und schneide mit einer kleinen Schere die restlichen Teile der Hornhaut ab.

Entfernen Sie dann die Linse und den Glaskörper und stellen Sie sicher, dass die Netzhaut an der Augenmuschel haftet. Legen Sie es in ein leichtes, dichtes Gefäß, das mit Zielen gefüllt ist. Äquilibriertes Medium mit 5 % Kohlendioxid in 95 % Sauerstoff bei 32 Grad Celsius.

Nächste Hemis Sek. Eine der Augenmuscheln mit einer Skalpellklinge mit der Nummer 10. Trennen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel.

Entfernen Sie die Ränder der Netzhaut, damit das Gewebe flach leben kann. Verwenden Sie eine kleine Glaspipette mit einem Latexkolben, um eine 35-Millimeter-Petrischale, mit geschmolzenem Agar mit niedriger Geliertemperatur zu füllen, und ziehen Sie die Pinzette durch den Agar, um seine Konsistenz zu testen. Sobald der Agar zu verfestigen beginnt, übertragen Sie die Netzhaut auf die Oberseite des Agars.

Verwenden Sie dann, ohne die Netzhaut zu berühren, ein gedrehtes Stück Kim-Tuch, um die überschüssige Lösung um das Tuch herum aufzunehmen. Geben Sie weitere zwei bis drei Tropfen Agar direkt auf die Netzhaut und platzieren Sie schnell einen Plastikzylinder, um eine Wand um sie herum zu bilden, während Sie die Netzhaut in der Nähe der Mitte des Zylinders halten. Tropfen Sie zusätzlichen geschmolzenen Agar hinein und geben Sie die Petrischale zum Abkühlen in ein Eiswasserbad. Entfernen Sie nach 30 Sekunden das Gewebe und extrudieren Sie den Agarblock mit einem Kolben, indem Sie ihn von der Seite aus drücken, die am weitesten von der Netzhaut entfernt ist.

Schneiden Sie mit einer einseitigen Rasierklinge einen kleinen Agarblock aus, der die Netzhaut enthält, und kleben Sie den Block mit Sekundenkleber gegen den Agar-Rücklaufsperre auf der Probenscheibe. Übertragen Sie die Probenscheibe auf den vibrierenden Mikrotombaum und gießen Sie eiskalte Häufchen in den Baum, so dass der Block mit der Netzhaut vollständig eingetaucht werden kann. Schneiden Sie Netzhautscheiben mit einer Dicke von etwa 200 Mikrometern mit der maximalen Klingenvibrationsrate und einer so eingestellten Klingengeschwindigkeit nach vorne, dass es vier bis fünf Sekunden dauert, die Netzhaut zu durchtrennen. Einmal.

Verwende eine Skalpellklinge mit der Nummer 11, um jede brauchbare Scheibe einzeln aus dem Block zu schneiden. Legen Sie die Scheiben mit der Netzhaut in die Aufnahmekammern und halten Sie sie gedrückt. Mit Hilfe von Scheibenankern werden die Nylonfäden verwendet, die den Scheibenanker kreuzen.

Halten Sie den Agar, der die Netzhaut umgibt, nach unten, so dass die Netzhaut frei bleibt. Für Aufnahmen. Übertragen Sie die Aufnahmekammer auf den Tisch des aufrechten Mikroskops.

Schließen Sie den Vorhang und schalten Sie die Infrarotlichtquelle ein, um das Slice auf einer infrarotempfindlichen Kamera zu betrachten. Identifizieren Sie unter dem Mikroskop einen Netzhautschnitt mit intakten Photorezeptoren im entsprechenden Schnittwinkel. Durch den Schneidevorgang können einige Oberflächenschäden sichtbar sein.

Saugen Sie mit einer Pipette mit abgebrochener Spitze vorsichtig die toten Zellkörper ab Um diese dünne Zellschicht zu entfernen, identifizieren Sie, sobald eine gesunde Schicht lebender Zellen freigelegt wurde, einen Zellkörper, dessen Position sich in den interessierenden Schichten befindet. Bewegen Sie die Pipettenspitze so, dass sie die Zellmembran vertieft, und üben Sie einen sanften, negativen oder nach innen gerichteten Druck aus, um eine hochohmige Abdichtung zu erzielen. Der Ganzzellenmodus kann erreicht werden, indem ein Unterdruck auf die Elektrode ausgeübt wird, um in die Zelle einzudringen.

Stimulieren Sie anschließend das Netzhautgewebe mit Licht und verwenden Sie LEDs, um Reaktionen hervorzurufen. Nehmen Sie am Ende der Aufzeichnung ein Bild mit dem entsprechenden Anregungslicht für das Fluor auf, das aus der internen Lösung der Pipette in die Zelle dialysiert wurde. Hier werden lichtevozierte Potentiale eines dunkel adaptierten retinalen Neurons zu Lichtblitzen zunehmender Stärke gezeigt.

Diese Abbildung ist ein Fluoreszenzbild, das von einer Netzhautscheibe aufgenommen wurde, in der die Zellen mit dem Fluor Lucifer gelb evozierten Fluoreszenz gefüllt wurden, zeigt die Morphologie der Zellen, von denen Patch-Aufzeichnungen gemacht wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis für einige der Komplexitäten haben, die mit der Erstellung von Patch-Clamp-Aufnahmen von dunkel adaptierten Netzhautschnitten verbunden sind. Ziel dieses Verfahrens ist es, die durch Licht evozierten Reaktionen unter kontrollierter Beleuchtung zu messen.

Um dies zu tun, müssen wir zuerst die Netzhaut isolieren, sie in eine Schnecke einbetten und dann Netzhautschnitte vorbereiten, von denen wir Einzelzellaufnahmen machen können.