Name: Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Patch-Clamp-Methode für Netzhautneuronen der Maus in dunkeladaptierten Schnitten. Diese Technik ermöglicht elektrophysiologische Aufzeichnungen zur Untersuchung retinaler Signalwege.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Grant EY17606 (APS) unterstützt.

1. Herstellung von Elektroden <ol><li> Bereiten Sie die Aufnahme-und Referenz-Elektroden durch Eintauchen sowohl in 1M NaCl und Fahren 15V zwischen ihnen mit einer 1 Hz Sinuswelle für ~ 20 s. </li><li> Machen Sie die Aufnahme Elektroden mit einer Mikropipette Puller (Sutter Instruments P-97). Für Patch-Pipetten mit einem Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,2 mm und einem Innendurchmesser von 0,69 mm (Sutter Instruments, Kat. Nr. B120-69 bis 10). Messen Sie den Serienwiderstand durch die Spitze der Elektrode. Basierend auf der Größe der Zielzellen wählen Sie eine Pipettenspitze Durchmesser für die Zellkörper ~ 20 um im Durchmesser verwenden ~ 5 MW für Zellkörper ~ 5 um im Durchmesser verwenden ~ 12 MOhm. </li><li> Bereiten Boden / Referenzelektroden. Mit einer Spritze füllen einen kleinen Ausschnitt aus Polyethylen-Schlauch (Intramedic, PE205) mit 1 mM NaCl, dass 3,5% Agar enthält (Sigma; Cat # A7002) in 1M NaCl. Legen Sie dieses Agar Brücke über die Ag / AgCl-Referenzelektrode. </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen <ol><li> Externe Badlösung, Ames 'Medien mit Bicarbonat (1 L): 1 Flasche Ames' Medium (Sigma; Cat # A1420), 1,9 g NaHCO 3, 7 ml Penicillin-Streptomycin (Sigma, Kat. Nr. P0781) zu verhindern, bakterielle Wachstum. Passen Osmolarität auf ~ 280 mOsm. </li><li> Slicing-Lösung, Ames 'Medien mit dem pH-Puffer HEPES (1 L): 1 Flasche Ames' Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 ml Penicillin-Streptomycin. Der pH-Wert auf ~ 7,4 mit 1 M NaOH und / oder 1 M HCl. Passen Osmolarität auf ~ 280 mOsm. </li><li> Kalium-Aspartat (K-Asp) Pipette interne Lösung (in mM): 125 K-Aspartat, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl 2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH-Wert wird eingestellt ~ 7,3 mit NMG-OH, und Osmolarität auf ~ 280 mOsm eingestellt. </li><li> Agar Rücklaufsperre für die Stabilisierung niedriger Geliertemperatur Agarose mit der Netzhaut (5 Gew.%), 7,5 g Agar (Sigma; Cat # A7002) in 150 ml dH 2 O. geschmolzen </li></ol> 3. Day of Experiment <ol><li> Thaw ~ 1,5 ml K-Asp Internal Solution und dem Fluorophor Ihrer Wahl aus dem Gefrierschrank. Verdünnen Sie die Fluorophor auf die geeignete Konzentration, die empirisch ermittelt werden sollte. </li><li> Gießen Ames 'Medien mit NaHCO 3 (~ 200 ml) in die lichtdichte Vorratsbehälter und legen Sie dann in das Wasserbad (30-32 ° C) und im Gleichgewicht mit 5% CO 2 / 95% O 2-Gas </li><li> Fill-Flasche mit ~ 110 ml Ames 'Medien mit HEPES, auf Eis stellen und im Gleichgewicht mit 100% O 2. </li><li> Die restlichen Ames 'Medien mit NaHCO 3 in einem beheizten Reservoir auf der Oberseite des Faraday-Käfig, und im Gleichgewicht mit 5% CO 2 / 95% O 2-Gas. Parafilm verwendet werden, um das Gas in den Raum oberhalb der Lösung Falle sein. </li><li> Bereiten Sie die niedrigen Geliertemperatur Agarose (3%) durch Zugabe von 0,75 g (Sigma; Cat # A0701) zu 25 ml Ames 'Medien mit HEPES und Wärme der Lösung bei ca. 115 ° C um die Agarose zu schmelzen. Rühren, bis die Lösung klar, ohne Blasen, und speichern Sie in einem Wasserbad (ca. 42 ° C). </li><li> Füllen Sie eine Aufzeichnung Pipette mit dem K-Asp interne Lösung und überprüfen Sie die Spitze Widerstand. </li></ol> 4. Begin Experiment <ol><li> Euthanize der Maus und schnell zu entfernen, die Augen mit einer gebogenen Schere. Infrarot-Schutzbrillen sollten für alle Verfahren, um zu verhindern das Ausbleichen der visuellen Pigment verwendet werden. </li><li> Legen Sie die Augen auf ein Stück Filterpapier, um sie von Rollen, und mit einem dünnen doppelseitigen Klinge zu vermeiden, stellen einen Schlitz in die Hornhaut, während das Auge mit der Pinzette. </li><li> Sobald der Augapfel ist punktiert, übertragen sie Auge in eine Schale mit Ames 'Medien gefüllt. </li><li> Mit den Schlitz in die Hornhaut als Einstieg, sind kleine Schere zum Schneiden entfernt die restlichen Teile der Hornhaut, nach dem die Linse und Glaskörper entfernt werden können. Achten Sie darauf, dass die Netzhaut an der Augenmuschel bleibt, und speichern Sie die Augenmuschel in Dunkelheit bei 32 ° C in Ames 'media äquilibriert mit 5% CO 2 / 95% O 2. </li></ol> 5. Slicing <ol><li> Hemisect einer der Augenmuscheln und distanzieren der Netzhaut von der retinalen Pigmentepithels. Entfernen Sie die Ränder der Netzhaut, damit das Gewebe flach zu liegen. </li><li> Mit einem kleinen Glas Pasteur Pipette mit einer Latex-Glühlampe auf eine 35 mm Petrischale mit geschmolzenem Agar zu füllen, und ziehen Sie die Zange quer durch den Agar seiner Konsistenz zu testen. </li><li> Wenn Sie anfangen können, finden Sie in der Agar verfestigt: <ol class="lalpha"><li> Übertragen Sie die Netzhaut an die Spitze des Agar. </li><li> Verwenden Sie ein verdrilltes Stück Kimwipe um die überschüssige Lösung rund um die Netzhaut zu absorbieren. </li><li> Legen Sie 2-3 Tropfen Agar direkt auf die Netzhaut und schnell statt einer Kunststoff-Zylinder über die Netzhaut an einer Wand um sie herum zu bilden. Dann tropft zusätzliche geschmolzen Agar an den Seiten der Kunststoff-Zylinder, während die Zentrierung der Netzhaut im Agar. </li><li> Übertragen Sie die Petrischale to ein Eiswasserbad abkühlen lassen. </li></ol></li><li> Nach ~ 45 Sekunden entfernen Sie das Gewebe aus dem Eiswasserbad und mit einem Stößel zu extrudieren die Agar-Block aus der Kunststoff-Zylinder, Schieben von der Seite von der Netzhaut am weitesten. </li><li> Verwenden Sie die einseitigen Rasierklinge herausgeschnitten ein kleiner Block von Agar mit der Netzhaut und Sekundenkleber den Block in Position gegen die Agar Rücklaufsperre auf der Probe-Disc. </li><li> Die Probe-Disc auf die vibrierende Mikrotom Tablett und gießen eiskalten Ames HEPES in das Fach ermöglicht den Block mit Netzhaut vollständig eingetaucht werden. </li><li> Retinal Scheiben mit einer Dicke von ca. 200 mu m kann die maximale Klinge vibriert Zinssenkung und eine vorausschauende Klinge Geschwindigkeit so eingestellt, dass es 4 bis 5 Sekunden dauert, um durch die Netzhaut auf jede Scheibe geschnitten. </li><li> Verwenden Sie einen Nr. 11 Skalpell zu jedem brauchbaren Scheibe ein zu einer Zeit zu entfernen </li><li> Gute Scheiben, die Netzhaut sind in der Aufnahme Kammern gelegt und sich mit Scheibe Anker mit Nylonfäden Kreuzung ihnen gewichtet. Die Nylonfäden halten Sie die Agar-Umgebung der Netzhaut, so dass die Netzhaut ungehindert für Aufnahmen. </li><li> Übertragen Sie die Aufnahme Kammer auf die Bühne des aufrechten Mikroskop, in der Nähe der Vorhang, und schalten Sie den Infrarot-Lichtquelle, um die Scheibe auf eine Infrarot-sensitive Kamera-Ansicht. </li></ol> 6. Aufnahme <ol><li> Sobald eine gute Netzhaut schneiden (mit intakten Photorezeptoren und den entsprechenden Schnittwinkel) identifiziert beginnen Perfusion der Netzhaut mit einer Rate von mehr als 5 ml / min mit beheiztem Ames 'Medien, die 35 37 ° C erhitzt wird und äquilibriert mit 5% CO 2 / 95% O 2. </li><li> Einige Beschädigung der Oberfläche kann offensichtlich durch die Slicing-Prozess. In der Regel dünne Schicht von Zellen kann mit Hilfe einer Pipette mit einem gebrochenen Spitze, und sanft Absaugen der Toten Zellkörper. Dies wird in der Regel zeigen lebende Zellen darunter. Identifizieren einer gesunden Zelle Körper, deren Position in den Schichten des Interesses. </li><li> Füllen einer Mikropipette mit dem Kasp interne Lösung und gelten positive (außen-) Druck durch die Spitze der Pipette, und senken Sie die Spitze der Pipette in die Aufnahme Kammer und bis auf die Ebene der Zelle mit einem Mikromanipulator. </li><li> Bewegen Sie die Pipette, so dass es die Zellmembran Grübchen, und wenden Sie sanfte negative (nach innen) Druck auf eine hohe Beständigkeit Dichtung zu machen. Whole-cell-Modus kann durch Anlegen von Unterdruck an der Elektrode in die Zelle zu brechen erreicht werden. </li><li> Förderung der Retina mit LEDs können dann rufen Reaktionen auf Licht. </li><li> Fotografieren Sie die Zelle, aus der die Aufnahme von evozieren die Fluoreszenz des Fluorophors in der Pipette interne Lösung gemacht wurde. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Hier Potenziale einer dunkeladaptierten Retina Neuron zu Lichtblitze von zunehmender Stärke gezeigt Licht hervorgerufen. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Fluoreszenz Bild aus einem der Netzhaut schneiden, wo Zellen mit dem Fluorophor, Lucifer Yellow gefüllt wurden. Evozierte Fluoreszenz zeigt die Morphologie der Zellen, aus denen Patch-Aufnahmen gemacht wurden.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

Slice-Aufnahme von Wirbeltieren Netzhaut seit Jahrzehnten 1,2 gemacht und waren recht erfolgreich bei der Bereitstellung ein tieferes Verständnis davon, wie die Netzhaut Schaltung kodiert einfallenden Lichts. Die Vorteile des Schneidens mit einem vibrierenden Mikrotom anstatt direkt mit einer Rasierklinge ist, dass die Netzhaut Scheiben weniger Schaden an der Oberfläche entstehen. Mit einer Saugpipette ist es leicht, diese Schäden und Ziel gesunde Zellen direkt unter der Oberfläche, dass ihre Verbindung in de...

<table><tbody><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borsilikatglas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit niedriger Gelier-Temperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Ames&amp;rsquo; Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp messungen von mouse netzhautneuronen in einem dark-scheiben angepasst vorbereitung

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Unser visuelles Erlebnis wird eingeleitet, wenn die visuelle Pigment in unserer Netzhaut Photonen des Lichts absorbiert und löst eine Kaskade von intrazellulären Ereignissen, die Schließung von zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kanäle in der Zellmembran führt. Die daraus resultierende Veränderung des Membranpotentials führt wiederum zu Kürzungen in Höhe von Neurotransmittern aus beiden Stäbchen und Zapfen synaptischen Terminals. Um zu messen, wie das Licht hervorgerufene Veränderung der Photorezeptor Membranpotentials führt zu nachgelagerten Aktivitäten in der Netzhaut, haben Wissenschaftler elektrophysiologischen Ableitungen von Netzhaut-Scheibe Vorbereitungen für Jahrzehnte 1,2 gemacht. In der Vergangenheit waren diese Scheiben wurden von Hand mit einer Rasierklinge auf die retinale Gewebe, das auf Filterpapier befestigt wird geschnitten, in den letzten Jahren eine andere Methode des Schneidens wurde entwickelt, wobei Netzhautgewebe in niedrigen Geliertemperatur Agar eingebettet ist und in Scheiben geschnitten in coole Lösung mit einem vibrierenden Mikrotom 3,4. Dieses Präparat produziert Netzhaut Scheiben mit weniger Beschädigung der Oberfläche und sehr robust Licht hervorgerufenen Reaktionen. Hier dokumentieren wir, wie dieses Verfahren unter Infrarot-Licht zu vermeiden, Bleichen der Sehpigment getan werden kann.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Unser visuelles Erleben beginnt, wenn das Sehpigment in unseren retinalen Photorezeptoren Photonen der Lichtenergie absorbiert und eine Kaskade von ... auslöst.

Unsere visuelle Wahrnehmung beginnt damit, dass der Sehpigment in den Fotorezeptoren unserer Netzhaut Photonen von Lichtenergie absorbiert, was letztendlich zur Schließung zyklischer, nukleotidgesteuerter Kanäle in der Zellmembran führt. Dies unterdrückt die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat sowohl aus Stäbchen als auch aus Zapfen. Das freigesetzte Glutamat wird von nachgeschalteten Netzhautzellen erfasst, um die nachgeschalteten Signale zu untersuchen.Die Augen werden von einer euthanasierten Maus entfernt. Die S werden isoliert, in einen Agarblock eingebettet und mit einem vibrierenden Mikrotom geschnitten. Anschließend werden die Netzhautschnitte unter ein Mikroskop gelegt und mit LED-Beleuchtung stimuliert.Während Patch-Clamp-Aufnahmen durchgeführt werden, um die erzeugten synaptischen Ströme oder Potenziale zu messen, werden Anfänger normalerweise Schwierigkeiten haben, da die Arbeit im Dunkeln zusätzliche Komplexität mit sich bringt. Daher vermittelt die Möglichkeit, den gesamten Prozess zu visualisieren, ein Gefühl, das sich andernfalls nur schwer beschreiben lässt.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die zur Aufzeichnung und als Referenz verwendeten Drahtelektroden mit einer Schicht aus Silberchlorid beschichten. Tauchen Sie die Elektroden in einmolares Natriumchlorid. Verwenden Sie dann eine 15-Volt-Stromquelle mit einer Sinuswelle von einem Hertz, um etwa 20 Sekunden lang 15 Volt zwischen ihnen anzulegen.Stellen Sie mit einem Mikropipettenzuggerät Patch-Pipetten aus feinpoliertem BO-Silikaglas her und wählen Sie einen Pipettenspitzenwiderstand entsprechend der Größe der Zielzellen, wobei für Zellkörper mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern ein Widerstand zwischen fünf und zehn Megaohm verwendet wird. Für Zellkörper mit einem Durchmesser von etwa fünf Mikrometern verwenden Sie einen Spitzenwiderstand von 12 bis 15 Megaohm.Um die Masselektroden herzustellen, füllen Sie mit einer Spritze Polyethylen-Schlauch mit einer 3,5 %igen Agar-Lösung, die in einkommaeiner Millimolar-Natriumchloridlösung hergestellt wurde. Bereiten Sie anschließend die folgenden Lösungen gemäß den Anweisungen im beiliegenden schriftlichen Protokoll vor: äußere Badlösung, Schneidelösung, pipetteninterne Lösung mit Kaliumaspartat und der Agar-Stopper.Lagern Sie alle Lösungen bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Am Tag des Experiments pipettieren Sie etwa 1,5 Milliliter Kaliumaspartat-Innenlösung. Geben Sie dann verdünntes Fluor hinzu.Geben Sie etwa 50 Milliliter AIMS-Medium mit Natriumbicarbonat in einen lichtundurchlässigen Vorratsbehälter. Schließen Sie den Kunststoffschlauch an einen Gastank mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff an, um das AIMS-Medium mit dem Gas zu equilibrieren, und stellen Sie den Behälter anschließend in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 30 bis 32 Grad Celsius. Füllen Sie danach eine Flasche mit 110 Millilitern AIMS-Medium, das die HEPEs enthält, und stellen Sie sie auf Eis.Äquilibrieren Sie das Medium, indem Sie die Lösung mit 100 % Sauerstoffgas durchbläsen. Geben Sie das verbleibende aimes-Medium, das Natriumbicarbonat enthält, in ein beheiztes Reservoir auf dem Faraday-Käfig. Wickeln Sie Parafilm um Schlauch und Flaschenverschluss, um das Gas im Raum über der Lösung einzuschließen und mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoffgas zu äquilibrieren.Unter Verwendung eines Glas-Luftverteilrohrs wird 3 % Agarose mit niedriger Gelier-Temperatur hergestellt, indem 0,75 Gramm in 25 Milliliter AIMs-Medium unter starker Hitze zugegeben werden. Die Lösung beträgt etwa 115 Grad Celsius während des Rührens. Sobald die Lösung blasenfrei klar wird, wird die geschmolzene Agarose-Lösung in ein Wasserbad von 42 Grad Celsius gegeben.Richten Sie die Aufnahmekammer auf dem inversierten Mikroskop ein. Schieben Sie eine fünf Zentimeter lange Agarbrücke über die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode und positionieren Sie sie in der Aufnahmekammer. Der Pipettenspitzenwiderstand kann gemessen werden, indem man eine Pipette mit der internen Lösung füllt, sie auf dem Pipettenhalter platziert, den Pipettenhalter in die Verstärkerkopfstufe einsetzt und die Pipette in die Lösung absenkt. Um das visuelle Pigment für physiologische Ableitungen zu erhalten, sollten alle Arbeitsschritte unter Infrarotlicht unter Verwendung von Infrarotbrillen durchgeführt werden, doch hier werden alle Schritte unter Raumlicht gezeigt.Nachdem die Maus euthanasiert wurde, entfernen Sie mit einer gebogenen Schere schnell die Augen. Legen Sie die Augen auf ein Stück Filterpapier, um ein Wegrollen zu verhindern. Halten Sie dann ein Auge mit einer Pinzette fest und machen Sie mit einer dünnen beidseitigen Klinge einen Einschnitt in die Hornhaut.Sobald der Augapfel durchstochen ist, überführen Sie das Auge in eine 60 Millimeter große Petrischale, die mit AIMs-Medium gefüllt ist. Benutzen Sie den Schlitz in der Hornhaut als Einstiegspunkt und schneiden Sie mit einer kleinen Schere die restlichen Teile der Hornhaut weg.Entfernen Sie dann die Linse und den Glask&ouml;rper, wobei sichergestellt werden muss, dass die Netzhaut am Augenbecher angeheftet bleibt. Legen Sie ihn in einen lichtdichten Beh&auml;lter, der mit AIMSMedium gef&uuml;llt ist, das mit 5&nbsp;% Kohlendioxid in 95&nbsp;% Sauerstoff bei 32&nbsp;Grad Celsius &auml;quilibriert wurde.Schneiden Sie als Nächstes eine halbe Schnittmenge eines der Augenbecher mit einer Skalpellklinge Nummer 10. Lösen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel ab.Entfernen Sie die Ränder der Netzhaut, um dem Gewebe zu ermöglichen, flach zu liegen. Verwenden Sie eine kleine Glas-Pasta-Pipette mit einem Latexballon, um eine 35-mm-Petri-Schale mit geschmolzenem Agar mit niedriger Geliertemperatur zu füllen, und ziehen Sie die Pinzette durch den Agar, um dessen Konsistenz zu prüfen. Sobald der Agar zu erstarren beginnt, übertragen Sie die Netzhaut auf die Oberfläche des Agars.Danach mit einem verdrehten Stück Kimwipe die überschüssige Flüssigkeit rings um die Netzhaut aufnehmen, ohne diese zu berühren. Weitere zwei bis drei Tropfen Agar direkt auf die Netzhaut geben und schnell einen Plastikzylinder daraufsetzen, um eine Wand darum zu bilden, wobei die Netzhaut nahe dem Zentrum des Zylinders gehalten wird; zusätzlichen geschmolzenen Agar tropfenweise hinzufügen, die Petrischale anschließend zur Abkühlung in ein Eiswasserbad überführen. Nach 30 Sekunden das Gewebe entfernen und einen Kolben verwenden, um den Agarblock herauszudrücken, wobei vom dem Netzhaut am weitesten entfernten Ende gedrückt wird.Verwenden Sie eine einseitige Rasierklinge, um einen kleinen Agarblock, der die Netzhaut enthält, auszuschneiden, und kleben Sie den Block mit Sekundenkleber an der Agar-Anschlagplatte auf der Probenscheibe fest. Übertragen Sie die Probenscheibe auf den Vibrationsmikrotomtisch und füllen Sie kalte ACSF-Lösung in den Tisch, sodass der Block mit der Netzhaut vollständig untergetaucht ist. Schneiden Sie Netzhautschnitte mit einer Dicke von etwa 200 µm, wobei die maximale Schwingfrequenz der Klinge verwendet wird und die Vorschubgeschwindigkeit der Klinge so eingestellt ist, dass der Schnitt durch die Netzhaut vier bis fünf Sekunden dauert. Einmal.Verwenden Sie eine Skalpellklinge der Größe 11, um jeden verwendbaren Schnitt nacheinander aus dem Block zu schneiden. Legen Sie die Schnitte, die die Netzhaut enthalten, in die Ableitungskammern und befestigen Sie sie. Verwenden Sie zum Halten der Schnitte die Nylonfäden, die über den Slicehalter verlaufen.Halten Sie das Agar um die Netzhaut herum fest, sodass die Netzhaut unbehindert bleibt. Für die Ableitungen. Bringen Sie die Ableitkammer auf den Objekttisch des aufrechten Mikroskops.Schließen Sie den Vorhang und schalten Sie die Infrarotlichtquelle ein, um den Schnitt mit einer auf Infrarot empfindlichen Kamera zu betrachten. Identifizieren Sie unter dem Mikroskop einen Netzhautschnitt mit intakten Photorezeptoren im geeigneten Schneidewinkel. Aufgrund des Schneidvorgangs können geringfügige Oberflächenschäden sichtbar sein.Entfernen Sie mit einer Pipette mit abgebrochener Spitze vorsichtig die toten Zellkörper. Um diese dünne Zellschicht zu entfernen, sobald eine gesunde Schicht lebender Zellen sichtbar ist, identifizieren Sie einen Zellkörper, dessen Position in der gewünschten Schicht liegt. Bewegen Sie die Pipettenspitze so, dass sie die Zellmembran eindellt, und üben Sie sanften negativen oder nach innen gerichteten Druck aus, um eine hochwiderständige Dichtung zu erzeugen. Der Ganzzellmodus kann erreicht werden, indem negativer Druck auf die Elektrode ausgeübt wird, um in die Zelle einzudringen.Als Nächstes stimulieren Sie das Netzhautgewebe mit Licht unter Verwendung von LEDs, um Antworten hervorzurufen. Am Ende der Aufzeichnung erfassen Sie ein Bild mit dem geeigneten Anregungslicht für den Fluor, der aus der intrapipettären Lösung in die Zelle dialysiert ist. Hier sind lichtinduzierte Potentiale eines dunkeladaptierten Netzhautneurons auf Lichtblitze zunehmender Stärke dargestellt.Diese Abbildung ist ein Fluoreszenzbild, das von einem Netzhautschnitt aufgenommen wurde, bei dem die Zellen mit dem Farbstoff Lucifer Yellow gefüllt wurden; die hervorgerufene Fluoreszenz zeigt die Morphologie der Zellen, von denen aus Patch-Aufzeichnungen durchgeführt wurden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis für einige der Komplexitäten gewinnen, Patch-Clamp-Aufzeichnungen von dunkeladaptierten Netzhautschnitten anzufertigen. Ziel dieses Verfahrens ist es, lichtinduzierte Antworten unter kontrollierter Beleuchtung zu messen.Um dies zu erreichen, müssen wir zunächst die Netzhaut isolieren, sie in Agar einbetten und anschließend Netzhautschnitte herstellen, aus denen wir Einzelzellableitungen vornehmen können.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt den Prozess der whole-cell voltage clamp Aufnahmen in der Netzhaut Scheibe der aquatischen Tiger Salamander. Wir zeigen die Herstellung der Scheibe als auch, wie man Patch Clamp Messungen während visueller Stimulation der Netzhaut führen.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

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Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

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Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

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Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

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