Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

Aus entzellularisiertem, perikardialem und myokardialem Gewebe hergestellte Matrixgele enthalten native Bestandteile der extrazellulären Matrix, darunter vielfältige Proteine, Peptide und Glykosaminoglykane. Diese Gewebematrizes können für das Gewebeengineering verwendet werden. In diesem Video werden Matrixgele durch die Entzellularisierung von Perikardgewebe hergestellt, um eine zellfreie extrazelluläre Matrix zu erhalten.

Die extrazelluläre Matrix wird anschließend verarbeitet, um eine solubilisierte flüssige Form zu erzeugen. Danach wird die solubilisierte Matrix in einem kleinen Tiermodell daraufhin getestet, ob sie als injizierbares Gerüst geeignet ist. Histologische und immunhistochemische Analysen zeigen, dass das injizierte Material in vivo ein poröses faseriges Gerüst bildet, das die Einwanderung vaskulärer Zellen ermöglicht.

Mein Name ist Sonia Zeki. Ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Karen Chrisman an der University of California San Diego. Heute werden wir lösliches ECM aus entzellularem Gewebe herstellen und die Anwendung in der Herzgewebeengineering durch in-vivo-Tests demonstrieren.

Diese Techniken sind wichtig für die Entwicklung einer injizierbaren Biomaterialtherapie zur Behandlung von Herzinsuffizienz. Nach dem Myokardinfarkt wird das chirurgische Vorgehen von Pam, Shoot McGuffin, einer veterinärmedizinischen Neurochirurgin in unserem Labor, demonstriert. Beginnen wir also.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Entzellularisierung des Gewebes, um zunächst nur die extrazelluläre Matrix oder ECM zu erhalten. Geben Sie dazu Schweineperikard in einen Becher mit entionisiertem Wasser und waschen Sie es, indem Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Nach dem Waschen legen Sie das Gewebe in 1× PBS, das 1 % SDS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, und rühren kontinuierlich 24 Stunden bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag geben Sie das Gewebe zurück in entionisiertes Wasser und rühren kontinuierlich fünf Stunden lang um, wobei Sie es in einem 50-Milliliter-Röhrchen schütteln, bis sämtlicher Schaum verschwunden ist.

Die Hämatin- und Eosin-Färbung sollte das Fehlen von Kernen im dezellularisierten Gewebe zeigen. Geben Sie den Rest des dezellularisierten Gewebes in ein kegelförmiges Reagenzglas mit einem Volumen von 15 bis 50 Milliliter. Anschließend lagern Sie das Gewebe bei minus 80 Grad Celsius ein.

Trocknen Sie die gefrorenen Proben durch Gefriertrocknung unter sehr niedrigem Druck und sehr niedriger Temperatur vollständig ein. Je nach verwendeter Anlage und Wassergehalt der Proben kann dies zwischen 12 und 72 Stunden dauern. Sobald das entzellulierte Gewebe vollständig trocken ist, überführen Sie es in eine Wiley-Minim-Mühle.

Unter Verwendung eines Siebs mit 40er Maschenweite das Gewebe zu einem feinen Pulver zermahlen. Sobald der größte Teil der Probe das Sieb passiert hat, das Sammelgefäß entfernen. Diese Probe wird nun als extrazelluläre Matrix oder ECM-Pulver bezeichnet.

Ein zweiter Lyophilisierungsschritt kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden, falls nicht unmittelbar mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Dies gewährleistet die Genauigkeit der erfassten Masse zur Lösung der ECM. Wägen Sie die gewünschte Menge an ECM-Pulver in ein steriles Reaktionsgefäß ab.

Geben Sie eine sterilfiltrierte Salzsäurelösung mit einem Gehalt von einem Milligramm pro Milliliter Pepcid in das Szintillationsfläschchen mit dem ECM-Pulver, sodass das ECM eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter erreicht. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und stellen Sie das Fläschchen auf das Rührgerät.

Rühren Sie kontinuierlich 48 bis 60 Stunden lang um, wobei Sie regelmäßig die Innenwände des Gefäßes mit einem sterilen WHE-Löffel oder Spatel abkratzen, um eine vollständige Verdauung des ECM-Pulvers sicherzustellen. Während das ECM verdaut wird, löst es sich in der Lösung auf.

Nachdem die ECM solubilisiert wurde, das Probenmaterial auf Eis stellen und den pH-Wert mit Natriumhydroxid und Salzsäure auf 7,4 einstellen. Sobald der pH-Wert angepasst ist, 10-fach PBS hinzufügen, sodass die endgültige Konzentration der Lösung 1-fach PBS beträgt. Zum Beispiel sollten bei 900 Mikrolitern ECM-Lösung nach der pH-Anpassung 100 Mikroliter 10-fach PBS hinzugefügt werden.

Bestimmen Sie die Konzentration der solubilisierten ECM-Lösung, indem Sie die hinzugefügten Volumina zur Neutralisierung sowie die entnommenen Volumina zur pH-Prüfung summieren. Anschließend wird eine fache PBS-Lösung hinzugefügt, um hier die gewünschte Endkonzentration zu erreichen. Sechs Milligramm pro Milliliter.

Am Tag der Operation bereiten Sie eine 75 Mikroliter große Injektion von gelöstem ECM in einer 0,1-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel vor. Halten Sie die Anästhesie einer intubierten weiblichen Harlan-Dolly-Ratte mit 2,5 % Isofluran aufrecht. Tragen Sie Augensalbe auf und überprüfen Sie anschließend die Anästhesie durch einen Zehenquetschtest.

Geben Sie drei Milliliter Ringer-Laktat-Lösung durch subkutane Injektion in den Unterbauch zur Flüssigkeitszufuhr. Danach bringen Sie das Tier in Rückenlage auf den Operations­tisch und befestigen die Gliedmaßen vorsichtig mit Klebeband. Benutzen Sie einen Haarschneider, um das Bauchfellhaar zu entfernen, und saugen Sie lose Haare ab.

Geben Sie eine Serie von 50 Mikroliter-Injektionen mit 2 % Lidocain entlang einer Diagonale vom Schwertfortsatz bis zur rechten unteren Bauchseite ab. Anschließend reinigen Sie dreimal mit Betadine, beginnend in der Mitte und sich nach außen bewegend. Wiederholen Sie die Reinigung mit Isopropanol.

Dann bedecken Sie das Tier mit einem chirurgischen Tuch, das über eine vorgefertigte kreisförmige Öffnung verfügt. Sichern Sie es mit einem chirurgischen Tuch. Verwenden Sie ein Skalpell der Größe 10.

Führen Sie einen drei bis vier Zentimeter langen Schnitt vom Schwertfortsatz bis zur rechten unteren Bauchseite durch. Lokalisieren Sie den Schwertfortsatz und dissezieren Sie vorsichtig senkrecht durch die Muskulatur nach rechts, wobei Sie darauf achten müssen, das große Gefäß auf der rechten Seite zu vermeiden. Verwenden Sie anschließend eine Schere, um lateral durch die Muskulatur zu schneiden und das Zwerchfell freizulegen.

Seien Sie vorsichtig, um die Leber zu vermeiden, und verwenden Sie ein 91 cm langes dreifach null Vicryl-Nähmaterial und eine Pinzette. Führen Sie eine Nadel durch den Xiphoidprozess und ziehen Sie das Nähmaterial zur Hälfte hindurch. Verkleben Sie die Enden des Nähmaterials miteinander und befestigen Sie sie an einem Punkt oberhalb und hinter dem Tier, heben Sie den Xiphoid nach oben und legen Sie das Zwerchfell mit einem weiteren 91 cm langen dreifach null Vicryl-Nähmaterial frei.

Führen Sie eine Nadel durch den Muskel, der der Xiphoidfortsatz am nächsten liegt, ziehen Sie erneut durch und befestigen Sie das Ende an einem weiteren Punkt rechts des Operationstisches, um die Operationshöhle vollständig freizulegen. Verwenden Sie als Nächstes ein kleines Paar Rattenzahn-Mikrozangen, um die Mitte des Zwerchfells zu greifen, ziehen Sie es heraus und führen Sie mit stumpfen Scheren einen sehr kleinen Einschnitt durch. Sobald dieses Loch angelegt ist, ziehen sich die Lungen zurück.

Führen Sie einen zwei bis drei Zentimeter langen vertikalen Schnitt durch das Zwerchfell durch, um das Herz sichtbar zu machen. Führen Sie dann einen drei Zoll langen Tupfer links in die Körperhöhle ein und schieben Sie die Lunge beiseite. Befestigen Sie den Tupfer mit einer Handtuchklemme an Ort und Stelle.

Verwenden Sie einen weiteren Tupfer, um den rechten Lungenflügel beiseitezuschieben, um die Perikardhöhle zu lokalisieren. Dann reißen Sie mit einem Paar Mikrozangen und einem Paar großer gezackter Pinzetten die Perikardhöhle auf, wodurch die Herzspitze freigelegt wird. Greifen Sie die Herzspitze mit der rechten gezahnten Mikrozange und führen Sie die Nadel so ein, dass die abgeschrägte Kante nach links zeigt, um die gelöste Matrix zu injizieren.

Eine drittel der Strecke ausgehend von der Spitze parallel zur epikardialen Oberfläche. Achten Sie darauf, die große Herzvene zu vermeiden. Injizieren Sie das gelöste Matrixgel und warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel entfernen.

Das Gewebe sollte an der Injektionsstelle weiß werden; wischen Sie Blut aus der Körperhöhle ab und entfernen Sie die Pinzette und den Tupfer, die die rechte Lunge halten, unter Verwendung von gebogenen mikrochirurgischen Hämostaten. Legen Sie einen Anfangsknoten mit einem 30 Zoll langen Faden aus 5-0-Proline-Nahtmaterial an. Schließen Sie dann mit einer Rattenzahn-Mikrozange das Zwerchfell mit einer kontinuierlichen Naht und einer konischen Nadel vollständig. Führen Sie PE-160-Saugrohr ein und schließen Sie es ab, indem Sie eine 10-Milliliter-Spritze verwenden, um die Brusthöhle zu entleeren.

Während die Naht straffer gezogen wird, sollte das Zwerchfell konkav sein. Reduzieren Sie die Eisfluorierung auf 1 %. Entfernen Sie beide Vicryl-Nähte der Stärke 3-0, die die Kavität geöffnet halten. Befeuchten Sie den Muskel und entfernen Sie Überschuss mit einem Tupfer oder steriler Gaze.

Verwenden Sie eine neue Länge einer 3-0-Naht, um die Muskelschicht mit Einzelknopfnähten zu verschließen. Danach schalten Sie das Isofluran aus. Reinigen Sie die Region und verschließen Sie die Haut mit Hautheftclips.

Tragen Sie dann eine dreifache antibiotische Salbe auf die Inzisionsstelle auf. Lassen Sie die Ratte unter 100 % Sauerstoff aus der Narkose aufwachen. Wenn das Tier beginnt, um den Beatmungsapparat herum zu atmen, entfernen Sie den Trachealtubus.

Sobald das Tier wieder auf den Beinen steht, verabreichen Sie eine subkutane Injektion von 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphinhydrochlorid-Analgetikum und bringen Sie es auf ein steriles Tuch in den Heimkäfig zurück. Herzgewebe von Ratten, die mit löslichen Matrixgelen injiziert wurden, wurde geschnitten und mit Hämat, Eosin und Eoin zur groben Gewebeanalyse zu verschiedenen Zeitpunkten gefärbt. Unmittelbar nach der Operation erscheint die injizierte Region zu frühen Zeitpunkten als rosa faseriges Netzwerk, das sich zu späteren Zeitpunkten interstitiell ausgebreitet hat.

Der Zelleinstrom wird nach zwei Wochen beobachtet. Der Abbau der injizierten Matrix ist sichtbar. Falls die ECM vor der Injektion mit Biotin markiert wurde, kann sie durch Anfärbung des Biotins mit HRP-konjugiertem Streptavidin direkter sichtbar gemacht werden, um das Einwachsen und die Bildung von Gefäßen im Bereich der Matrixinjektion zu visualisieren.

Die hier gezeigten Präparate wurden doppelt gefärbt mit einem fitzy-konjugierten Selektin, das an Endothelzellen bindet und in grün dargestellt ist, sowie mit einem Antikörper gegen glatte Muskel-Aktin, der in rot dargestellt ist. Stammzellen können ebenfalls in der Nähe der Injektionsregion identifiziert werden.

Hier wurden sie mit einer Immunhistochemie-Färbung für C-Kit sichtbar gemacht. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lösliches ECM aus entzelluliertem Gewebe herstellt und in vivo für Anwendungen im Bereich des kardialen Gewebes Engineering testet. Vergessen Sie nicht, dass dieses allgemeine Verfahren, obwohl wir Perikardgewebe verwenden, modifiziert werden kann, um mit jeder beliebigen Gewebequelle verwendet zu werden.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.