Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die RNA-Analyse: Eine Technik zur Trennung von fluoreszenzmarkierten phosphorylierten RNA-Oligonukleotiden von ihren nicht-phosphorylierten Äquivalenten

Entnehmen Sie zunächst eine Probe, die fluoreszenzmarkierte phosphorylierte und nicht-phosphorylierte RNA-Oligonukleotide enthält, die mit dem Beladungsfarbstoff gemischt sind, der Harnstoff enthält. Erhitzen Sie die Probe.

Harnstoff - ein starkes Vergällungsmittel - in Kombination mit der Hitze denaturiert die sekundäre RNA-Struktur, was zu ihrer linearisierten und unstrukturierten Konformation führt. Gießen Sie nun das Gel, indem Sie die Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung mit Harnstoff mischen.

Fügen Sie Tetramethylendiamin, einen Katalysator, und Ammoniumpersulfat, ein Oxidationsmittel, hinzu, um die anschließende Gelpolymerisation zu erleichtern.

Gießen Sie die Lösung in eine vormontierte Kassette. Führen Sie einen Kamm ein, um Vertiefungen für die Probenbeladung zu erstellen. Lassen Sie das Gel polymerisieren. Setzen Sie die Kassette in das Gelgerät ein. Fügen Sie dem oberen und unteren Reservoir einen laufenden Puffer hinzu und halten Sie den Stromfluss durch das gesamte Gel aufrecht. Den Kamm entfernen.

Laden Sie die mit Visualisierungsfarbstoff vermischte Probe in die Vertiefung und schließen Sie das Gel an eine Stromversorgung mit der gewünschten Spannung an. Der Harnstoff im Gel ermöglicht es RNA-Molekülen, als lineare Spezies zu wandern.

Das Gel wirkt wie ein Sieb, das es den negativ geladenen RNA-Molekülen ermöglicht, sich durch die Poren in Richtung der positiven Elektrode zu bewegen. Während des Laufs bewegt sich die phosphorylierte RNA, die von Natur aus negativer ist, schneller als nicht-phosphorylierte RNA.

Stellen Sie das Gel für den Nachweis von fluoreszenzmarkierter RNA dar. Beobachten Sie die Mobilitätsverschiebung zwischen der schneller migrierenden phosphorylierten RNA, die im Vergleich zur unphosphorylierten RNA als untere Bande erscheint.