Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, kompartimentelle Translationsereignisse zu visualisieren und zu quantifizieren, die während der ersten Schritte der Zelladhäsion stattfinden. Diese Methode ist vielseitig einsetzbar. Verwenden Sie es immer dann, wenn eine schnelle spezifische Translationsreaktion getestet werden kann, z. B. bei der Analyse von Zellmigration, Adhäsion oder frühem Ansprechen auf Arzneimittel.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach, schnell und kostengünstig ist. Es werden nur Puromycin, Antikörper, die gegen Puromycin gerichtet sind, und das standardmäßige konfokale Scan-Bildgebungssystem benötigt. Stellen Sie zunächst eine Suspension aus MRC-5-Zellen her.

Verwenden Sie die Trypsinisierung, gefolgt von der Zentrifugation, der Entfernung des Überstands und der Resuspension in DMEM mit zehn Prozent FBS bei 40 Tausend Zellen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Suspension mit sanfter Drehung für 20 Minuten, um die fokalen Adhäsionskomplexe vollständig zu dissoziieren. Das ist entscheidend.

Geben Sie dann in zwei 35-Millimeter-Glasbodenschalen zwei Milliliter Aliquot-Suspension und inkubieren Sie sie, um die Zelladhäsion und die SiC-Bildung zu ermöglichen. Behandeln Sie nach 40 Minuten eine Platte mit Cycloheximid und stellen Sie sie wieder in den Inkubator. Diese Platte fungiert als Negativkontrolle.

Tragen Sie nach 55 Minuten Puromycin in der vorgegebenen Konzentration auf beide Platten auf und inkubieren Sie die Platten weitere fünf Minuten lang. Nach einer Stunde Aussaat und fünf Minuten Puromycin in Kooperation waschen Sie jeden Teller zweimal mit zwei Millilitern eiskaltem PBS. Fixieren Sie dann die Zellen mit einem Milliliter vierprozentigem Formaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Fixierung waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und permeabelisieren Sie die Zellen dann mit 500 Mikrolitern 0,5 Prozent Triton X-100 in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die Platten dreimal mit PBS und tragen Sie dann 500 Mikroliter ein Prozent BSA in PBS auf. Setzen Sie die Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 20 Minuten fort.

Um überschüssiges BSA zu entfernen, waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,1 Prozent Tween-20 in PBS. Inkubieren Sie nun die Zellen mit 300 Mikrolitern Anti-Puromycin-Antikörper. Entfernen Sie den ungebundenen Antikörper durch drei Waschgänge mit 0,1 Prozent Tween-20.

Als nächstes wenden Sie dreihundert Mikroliter einer Mischung aus zwei Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern an, um puromykolierte Polypeptide und de factem sichtbar zu machen. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Platten nach einer Stunde dreimal, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und tragen Sie dann dreihundert Mikroliter 0,1-prozentige Tween-20-Lösung auf, die mit DAPI ergänzt wird.

Lassen Sie das DAPI fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in den Zellen verbleiben. Zum Schluss waschen Sie die Zellen noch viermal und schließen Sie mit einer Wäsche in reinem PBS ab. Lagern Sie die Zellen dann in zwei Millilitern PBS für die Bildgebung.

Bestimmen Sie zunächst mit einem handelsüblichen konfokalen Bildgebungssystem die geeigneten Einstellungen, die den Dynamikbereich für die Quantifizierung maximieren. Der Fokus auf die Quantifizierung kann nur erreicht werden, wenn eine Sättigung der Peakgröße vermieden und die Konzentration richtig eingestellt wird. Die Einstellung kann durch sorgfältiges Einstellen des Laserleistungsvorteils und der Offsets erreicht werden.

Passen Sie zunächst den Zoomfaktor und die Anzahl der Pixel an, um die Pixelgröße zu optimieren. Tun Sie dies gemäß dem Nyquist-Theorem. Verringern Sie als Nächstes die Scan-Geschwindigkeit und verwenden Sie die Mittelwertbildung, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

Bestimmen Sie dann manuell die entsprechenden oberen und unteren Fokusebenen entlang der Z-Achse, und legen Sie die Schrittgröße fest, indem Sie die axiale Auflösung berechnen und diesen Abstand durch 2,3 dividieren. Das typische Ergebnis sind 20 bis 25 Bildebenen. Sobald die Einstellungen angepasst sind, können Sie ein konfokales Bild einer gesamten einzelnen Zelle mit einem 60-fachen Plan Apo Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,42 aufnehmen.

Um die Flurophorsignale zu quantifizieren und zu analysieren, öffnen Sie zunächst ein Bild, das der interessierenden z-Ebenenschicht in Bild J entspricht. Ziehen Sie dann mit dem Zeichenwerkzeug eine Linie durch die Zelle, wo eine Quantifizierung gewünscht ist. Ändern Sie als Nächstes den Linien-Whiff, indem Sie auf gerade doppelklicken. Die Intensitätswerte werden über die Breite der Linie gemittelt, verwenden Sie also eine dünnere Linie, um Signalüberlappungen von verschiedenen Strukturen zu vermeiden.

Profilieren Sie dann die Signaldichte entlang der Linie. Wiederholen Sie nun den Vorgang des Sammelns der Signaldichte entlang derselben Linie im Kanal, die einem Flurophor entspricht. Die Werte werden immer nach der Ausrichtung der Linie sortiert.

Kopieren Sie nun die Profildaten und fügen Sie sie zur Analyse in eine Tabelle ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie Daten von jedem Bild der Z-Ebene von Interesse erfassen, bevor Sie mit der statistischen Analyse fortfahren. Alternativ kann das Signal nicht entlang einer Achse gesammelt werden, sondern auch aus einem Bereich des Bildes.

Verwenden Sie zunächst die Funktion "Geometrische Form", um einen Bereich von Interesse auszuwählen. Passen Sie als Nächstes den Schwellenwert an, um jeglichen Hintergrund zu vermeiden. Verschieben Sie im Histogramm der Pixelintensitäten den Schieberegler, um anzupassen, welche Pixel in die Quantifizierung einbezogen werden.

Legen Sie den Schwellenwert so fest, dass alle roten Pixel außerhalb der Zelle entfernt werden. Definieren Sie nun die Messparameter, die erforderlich sind, um das Signal von Interesse und nicht das Hintergrundsignal zu messen. Schalten Sie den Grenzwert auf die Optionen Schwellenwert und integrierte Dichte um.

Verwenden Sie als Nächstes den Befehl "Messen". Es öffnet sich ein neues Fenster mit den mittleren Grauwerten und der Pixelanzahl im ausgewählten Bereich. Wiederholen Sie nun den Vorgang und wenden Sie denselben Schwellenwert an, um die Signalintensität in der gesamten Zelle zu bestimmen.

Verwenden Sie dann diese Daten, um das Verhältnis des Signals im ausgewählten Bereich zu dem der gesamten Zelle zu berechnen. Für eine genaue Messung von Translationsereignissen mittels Purmycin-Inkorporation wurden zunächst die optimalen Bedingungen für eine axiale Messung evaluiert. Es wurde ein Konzentrationsspektrum mit einer fünf- oder zehnminütigen Behandlung verglichen.

Die akzeptable Puromycin-Konzentration für MRC-5- und HeLa-Zellen war etwas höher als das, was für Huh-7-Zellen benötigt wird. Zellen, die zehn Minuten lang mit hohen Puromycin-Konzentrationen behandelt wurden, erzeugten meist kleinere puromykolierte Polypeptide. Die kleineren Polypeptide entschärften schneller und sind nicht erwünscht.

Die kürzere Inkubationszeit wurde daher als wünschenswerter erachtet. Die Behandlung mit Cycloheximid ist eine wirksame und wichtige Negativkontrolle. In MRC-5-Zellen wurde nach Behandlung mit Cycloheximid nur ein schwaches Puromycin-Signal nachgewiesen.

Mit Hilfe der axialen Signalquantifizierung konnte die allgemeine Lokalisation von puromykolierten Polypeptiden, die neu synthetisierten Proteinen entsprechen, auf verschiedenen Ebenen innerhalb der Zelle bestimmt werden. Auch eine quantitative Verteilung des Signals in der gesamten Zelle war möglich. Bei beiden Techniken war es wichtig, das Signal für jede Z-Ebene im Bildstapel zu quantifizieren, um die Translationsereignisse in einer ganzen Zelle genau beurteilen zu können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Translationsereignis im subzellulären Kompartiment ausgewertet werden kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb eines Tages durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn man über dieses Verfahren nachdenkt, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Konzentration von Puromycin und seine Inkubationszeit wichtig sind.

Um die Diffusion zu begrenzen, ist es vorzuziehen, die Inkubationszeit zu begrenzen. Es ist auch wichtig zu erkennen, dass die Qualität der Bildaufnahmeart entscheidend ist, um gute Ergebnisse zu erzielen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer chemischen Haube getroffen werden sollten.