Name: Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Immunfluoreszenzmethode zur Visualisierung lokalisierter Translation in MRC-5-Zellen während der Zelladhäsion. Diese kostengünstige Technik ermöglicht schnelle Analysen mit Standard-Konfokalmikroskopie.

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Wir danken Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Zelle Bildtrommel des Forschungszentrums für ihre technische Unterstützung. M.-É. Huot ist ein Junior 1 Research Scholar des Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (Anzahl CIHR, MOP-286437, M.-É zu gewähren. Huot).

1. Bestimmung der Puromycilation Bedingungen Hinweis: Diese Technik beschreibt die Methode verwendet, um lokalisierte Übersetzung während der MRC-5 Zelle Adhäsion Prozess 5 bewerten. Als Puromycilation in einer beliebigen Zelle getan werden kann, ist es wichtig, die Puromycilation Bedingungen für die spezifische Zelllinien verwendet werden, zu optimieren, da die Behandlungsbedingungen für jede Zelllinie in Bezug auf die Puromycin-Konzentration und die gewünschte nicht identisch Inkubationszeit. Um zu zeigen, wie diese Bedingungen definiert werden, drei Beispiel-Zelllinien (z. B. HeLa, MRC-5 und Huh-7) mit steigenden Konzentrationen von Puromycin für unterschiedliche Inkubationszeiten behandelt wurden ( Abbildung 1).
<ol><li>Wachsen identische Zahl von Zellen in einer 24-Well-Platte in 0,5 mL der entsprechenden runden Kulturmedium 16 h vor dem Test. 30.000 MRC-5 Samenzellen, 50.000 HeLa-Zellen oder 50.000 HuH-7 Zellen pro Bohrloch. Vermeiden Sie mehr als 60-70 % Zusammenfluss (Abbildung 1A).</li>
	<li>Rohre vorbereiten 6 mit 1,5 mL komplette Zellkulturmedium mit steigenden Konzentrationen von Puromycin (0, 5, 10, 15, 20 und 30 µg/mL). Bereits bei 37 ° c warme</li>
	<li>Für jede Konzentration von Puromycin Medium (vorbereitet in Schritt 1.2), transfer von 0,5 mL jeweils Tubus in 6 neue Rohre und alle 6 neue Rohre Cycloheximide auf eine Endkonzentration von 50 µg/mL hinzufügen. Bereits bei 37 ° c warme</li>
	<li>Das Medium mit 0,5 mL komplette Kulturmedium (Zeile 1 und 2) verändern. Für die dritte Zeile hinzufügen 0,5 mL komplette Kulturmedium ergänzt mit 50 µg/mL Cycloheximide ( Abbildung 1 b). 
	Hinweis: Cycloheximide Behandlung etablierte als die beste Negativkontrolle für Protein Puromycilation wegen seiner Fähigkeit, Übersetzung Dehnung zu blockieren. Da Puromycin Einbeziehung Übersetzung Dehnung erfordert, Cycloheximide Behandlung führt zu einem Verlust von Puromycilated Protein Signale 5 , 18.</li>
	<li>15 min bei 37 ° C (5 % CO 2) inkubieren.</li>
	<li>Hinzufügen 0,5 mL des Mediums Puromycin vorbereitet in Schritt 1.2 der zweiten Zeile zu Endkonzentrationen von 0, 2,5, 5, 7,5, 10 und 15 µg/mL, bzw. in den Spalten A, B, C, D, E und F. Zum gleichen Zeitpunkt hinzufügen 0,5 mL Puromycin Cycloheximide ergänzt Medium (Schritt 1.3) in der dritten Zeile ( Abbildung 1).</li>
	<li>5 min bei 37 ° C (5 % CO 2) inkubieren.</li>
	<li>Hinzufügen 0,5 mL des Mediums Puromycin vorbereitet in Schritt 1.2 in die erste Zeile zu Endkonzentrationen von 0.0, 2,5, 5, 7,5, 10 und 15 µg/mL ( Abbildung 1).</li>
	<li>5 min bei 37 ° C (5 % CO 2) inkubieren.</li>
	<li>Waschen jeweils gut von Zeilen 1 bis 3 mit 1 mL eiskaltes 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 5 min nach der Zugabe von Puromycin in Vertiefungen der ersten Zeile (zweimal waschen). Fügen Sie 75 µL 1 X Laemmli-Puffer (4 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 4 % 2-Mercaptoethanol, 0.120 M Tris-HCl pH 6,8, 0,004 % Bromophenol blue und 10 % Glycerin), ganze Zelle Lysates für jede Kondition zu erhalten.</li>
	<li>Run 10 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit 1/3 der vorbereiteten Proben Puromycin Aufnahme zu beurteilen.
	<ol><li>Bestimmen Sie die Höhe der Puromycin Einbeziehung von Western-Blot Analyse mit einem Anti-Puromycin Antikörper (12 D 10) in einem Verhältnis von 1: 25.000 in Primärantikörper Inkubation Puffer (2 % Rinderserumalbumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 und 0,01 % verdünnt Natriumazid). 
		Hinweis: Repräsentative Bilder entsprechend verschiedenen Zellextrakte Linie gemacht, wie in Schritt 1 beschrieben sind beispielhaft in Abbildung 2 gezeigt.</li>
	</ol></li></ol> 2. In Cellulo Lokalisierte Übersetzung Visualisierung Hinweis: die hier beschriebene Technik wurde verwendet, um lokalisierte Übersetzung innerhalb von SICs im MRC-5 Zellen während der Adhäsion Prozess 5 zu bewerten. Obwohl hier MRC-5 Zellen verwendet werden, können andere Zell-Linien mit der gleichen Methode im Schritt 2.1 beschrieben verwendet werden.
<ol><li>Handy-Vorbereitung.
	<ol><li>Trennen MRC-5 Zellen mit 0,25 % Trypsin/2,21 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Hank &#39; s ausgewogen Salz Lösung (HBSS). Pellet-Zellen durch Zentrifugation (5 min bei 200 X g) in einem 15 mL konische Zentrifugenröhrchen und hängen Sie sie in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 40.000 Zellen/mL nach Auszählung mit einer Zählkammer.</li>
		<li>Brüten die suspendierten Zellen bei 37 ° C unter sanften Drehung mithilfe einer Rohr-Rotator für 20 min, um sie in der Schwebe zu halten. 
		Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um die vollständige Dissoziation der komplexe fokale Adhäsion zu ermöglichen.</li>
		<li>Platte 2 mL der suspendierten MRC-5 Zellen (40.000 Zellen/mL) in zwei 35-mm-Glasboden-Gerichte. Verwenden Sie das erste 35-mm-Glasboden-Gericht für die Puromycilation-Assay (siehe Punkt 2.1.5) und die zweite als eine negative Kontrolle verwenden (siehe Schritt 2.1.6).</li>
		<li>Halten die Zellen bei 37 ° C (5 % CO 2) 55 min., um zelluläre Adhäsion und SIC Bildung zu ermöglichen.</li>
		<li>Add Puromycin auf das Medium in der 35-mm-Glasboden-Gerichte (Assay) mit der Konzentration, die zuvor definiert in Abschnitt 1. MRC-5 Zellen zu behandeln, verwenden Sie 10 µg/mL Puromycin für 5 min bei 37 ° C (5 % CO 2).</li>
		<li>Als Negativkontrolle, hinzufügen Cycloheximide in die zweite Schale 35 mm Glasboden 40 min nach der Aussaat der Zellen, um sie mit 50 µg/mL Cycloheximide ( Abb. 2 b) vorzubehandeln. 15 min nach Cycloheximide hinaus fügen dann Puromycin, das Medium mit der gleichen Konzentration und Inkubation Zeit wie in Schritt 2.1.5 (z. B. Verwendung 10 µg/mL Puromycin für 5 min bei 37 ° C (5 % CO 2) für die MRC-5).</li>
		<li>Waschen jede Platte zweimal mit 2 mL eiskaltes 1 X PBS und befestigen Sie die Zellen mit 1 mL 4 % Formaldehyd (in 1 X PBS verdünnt) für 15 min bei Raumtemperatur (RT). 
		Achtung: Paraformaldehyd muss ausschließlich verwendet in einer chemischen Kapuze.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>Nach Paraformaldehyd Fixierung, dreimal mit 2 mL 1 X PBS waschen und in 500 µL PBS-TritonX-100 (0,5 %) für 20 min bei RT in den Zellen permeabilize inkubieren.</li>
		<li>Um unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, blockieren die Probe mit 500 µL PBS &#8211; BSA (1 %) für 20 min bei RT</li>
		<li>Waschen Sie dreimal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und inkubieren Sie mit 300 µL Anti-Puromycin Antikörper (12 D 10) verdünnt 1:12,500 mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT.</li>
		<li>Waschen 3 Mal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und inkubieren Sie mit 300 µL Anti-Maus IgG konjugiert zu einem Fluorophore (hier, 488 nm) verdünnt mit PBS-Puffer Puromycilated Polypeptide zu visualisieren und mit Phalloidin konjugiert zu einem anderen Fluorophor (hier, 555 nm) F-Aktin zu visualisieren. 1 h bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen dreimal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und inkubieren Sie für 5 min bei RT in 300 µL PBS-Tween20 (0,1 %) ergänzt mit 1 µg/mL 4 &#39;, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
		<li>Waschen dreimal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und dann mit 2 mL 1 X PBS waschen. Verhindern, dass Zellen trocknen, indem man die Probe in 2 mL 1 X PBS während der Bildaufnahme.</li>
	</ol></li></ol> 3. Immunofluorescent Bildaufnahme Hinweis: die folgende Methode kann mit jedem handelsüblichen konfokale imaging-System verwendet werden.
<ol><li>Bestimmen Sie die entsprechenden Einstellungen für jede Fluorophor, den Dynamikbereich für die Quantifizierung zu maximieren. 
	Hinweis: Repräsentative Quantifizierung kann nur erreicht werden, wenn Pixel Sättigung vermieden wird und die Signalschwelle entsprechend werden korrigiert. Diese Einstellungen können werden erreicht durch sorgfältig anpassen der Laserleistung, Hochspannung (HV), erlangen, und ausgeglichen.
	<ol><li>Stellen Sie den Zoom-Faktor (5 X) und die Anzahl der Pixel (512 x 512) zur Optimierung der Pixelgröße. 
		Hinweis: Dies sollte mindestens 2,3 - Mal kleiner als die optische Auflösung nach Nyquist Theorem.</li>
		<li>Verringern Sie die Scangeschwindigkeit (12,5-20 µs/Pixel) und zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis entsprechend den oben genannten Einstellungen verwenden im Durchschnitt (2-3 Mal).</li>
	</ol></li> <li>Manuell bestimmen die entsprechenden oben und unten fokale Flächen entlang der z-Achse mit der optimalen Schrittweite (0,4 µm/Slice). 
	Hinweis: Schritt Größe Flugzeug wird durch die axiale Auflösung geteilt durch 2.3, nach dem Nyquist-Theorem bestimmt. In der Regel 20-25 Schichten sind notwendig, um die gesamte Zelle Tiefe der adhärenten Zellen decken.</li>
	<li>Erwerben eine konfokale Bild einer gesamten einzelnen Zelle mit einem 60 X Plan Apo Öl eintauchen Ziel (1,42 numerische Apertur).</li>
</ol> 4. Immunofluorescent Bild Quantifizierung <ol><li>Ermittlung der Bereicherung.
	<ol><li>Öffnen Sie ein Bild entspricht der Z-Ebene Schicht von Interesse aus der erworbenen Zelle Datendatei mit ImageJ-Software (Freeware erhältlich bei http://fiji.sc).</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Linie mit dem Zeichnen von Linien-Werkzeug (Tool-Bar &#8594; geraden) durch die Regionen der Zelle wo Quantifizierung ist erwünscht. Ändern Sie die Linienstärke durch Doppelklick auf &#34; gerade; &#34; die Intensitätswerte werden durch die Breite der Linie (eingestellt auf 8 in Abbildung 3) gemittelt werden. 
		Hinweis: Eine dünnere Linie wird bevorzugt, um Signal Überschneidungen aus unterschiedlichen Strukturen zu vermeiden.</li>
		<li>Nach die Zeile korrekt eingestellt ist, Profil Signaldichte entlang der festgelegten Achse (Menüleiste &#8594; Analyze &#8594; Plot-Profil). 
		Hinweis: Ein neues Fenster wird geöffnet, die ein Profil entsprechend der Signalintensität für jedes Pixel eines neu selektierten Kanals (spezifische Fluorophor) entlang der Linie für den ausgewählten Abschnitt der Z-Ebene zeigt.
		<ol><li>Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Kanal entspricht der Fluorophor verwendet (d. h. eine Quantifizierung für 488, eines für 568 und eines für 405). 
			Hinweis: Die Intensität Signalwert wird immer bestellt werden nach der Ausrichtung der gezeichneten Linie.</li>
		</ol></li> <li>Um die numerische grau skaliert Werte für jedes Pixel des Profils entspricht die Quantifizierungen der ausgewählten Ebene Z-Ebene zu erhalten, kopieren Sie die Profildaten (Menüleiste im Bildfenster &#8594; kopieren) und fügen Sie ihn in jedem Tabellenkalkulations-Software.</li>
		4.1.1-4.1.4 <li>Wiederholen Sie die Schritte für jeden Z-Plane-Abschnitt des erworbenen konfokale Bild und jeden Kanal wo Quantifizierung erwünscht. 
		Hinweis: Die Quantifizierung der verschiedenen Schichten der Z-Ebene kann gebündelt werden, um eine allgemeine Bewertung der besondere Bereicherung des Signals durch die Berechnung der Summenwert der einzelnen Pixel entlang der Linie für jede Z-Ebene Schicht zu erhalten. Diese Art der Bündelung kann nur erreicht werden, wenn die Linie gezogen für jeden Z-Ebene Layer enthalten in den Mittelwerten identisch ist.</li>
		<li>Als alternative Methode für die gesamte Zelle Quantifizierung verschiedener Kanäle mit einer großen Anzahl von Schichten, verwenden Sie das Makro StackprofileData aufgerufen (siehe die Zusätzliche Datei). 
		Hinweis: Dieses Makro ist https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt frei abrufbar und können wie folgt verwendet werden: <ol><li>fügen Sie das Makro in eine Textdatei und speichern Sie it.</li>
			<li>Öffnen Sie die Image-Datei, die alle die konfokalen Schichten der Zelle einschließt.</li>
			<li>Zeichnen Sie eine Linie, wie im Schritt 4.1.2 beschrieben, öffnen ein neues Fenster, um das Makro zu importieren (Menü-Leiste &#8594; Plugins &#8594; Makros &#8594; ausgeführt), wählen Sie die zuvor gespeicherte Textdatei entspricht das StackprofileData-Makro, und klicken Sie auf &#34; offen. &#34; 
			Hinweis: Nach Makro Einfuhr, ein neues Fenster namens &#34; Ergebnisse &#34; wird geöffnet und alle die Quantifizierung der ermittelten Achse wird für jede Z-Ebene Schicht aufgeführt werden und Kanal in die Image-Dateien vorhanden.</li>
			<li>Kopieren Sie die Daten für jeden Kanal (Menüleiste &#8594; bearbeiten &#8594; Kopie) die Grafikprofil Darstellung entspricht dem Signal Quantifizierungen zu erhalten. Fügen sie jedem Tabellenkalkulations-Software. Berechnen Sie den Summenwert der einzelnen Kanäle für jedes Pixel entlang der Linie für jede Schicht der Z-Ebene. Diese Werte verwenden, um eine grafische Darstellung ähnlich der in Abbildung 3 dargestellten erstellen.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Quantifizierung des Signals in einem bestimmten zellulären Bereich oder Volume.
	<ol><li>Öffnen Sie die Bilddatei mit ImageJ Software.</li>
		<li>Zeichnen Sie einen Bereich, um den gewünschten Bereich mit Hilfe der geometrischen Formularfunktion bezeichnen (Tool-Bar &#8594; &#34; Rechteck, &#34; &#34; Oval, &#34; oder &#34; Polygon &#34;). 
		Hinweis: Der Quantifizierung Wert wird für den Bereich entspricht die gezeichnete Form ermittelt werden.</li>
		<li>Der Schwelle Pegel um jede Hintergrundsignal zu vermeiden (Menüleiste &#8594; Bild zu justieren, &#8594; Schwelle); ein neues Fenster erscheint die Pixelintensität im Histogramm Form darzustellen. Ändern Sie die Werte um Pixel in der Quantifizierung mit Hilfe des Schiebereglers einschließen/ausschließen. Wählen Sie eine Schwelle, die roten Pixel außerhalb der Zelle beseitigt, wie Pixel rot markiert in der Quantifizierung aufgenommen werden.</li>
		<li>Definieren die Messparameter zur Quantifizierung der Pixel-Signal innerhalb des ausgewählten Bereichs ohne Hintergrundsignal (Menüleiste &#8594; Analyze &#8594; Messungen festgelegt), und überprüfen Sie die &#34; Grenze für die Schwelle &#34; und die &#34; integrierte Dichte &#34; Boxen.</li>
		<li>Messen die quantitative Werte für den ausgewählten Bereich (Menüleiste &#8594; Analyze &#8594; Maßnahme). 
		Hinweis: Signal Intensität Quantifizierung präsentiert werden in einem neuen Fenster unter der &#34; IntDen &#34; Identifikation, die das Produkt aus grauen Mittelwerte und die Anzahl der Pixel innerhalb des ausgewählten Bereichs darstellt.</li>
		<li>Zeichnen ein Gebiet, das die gesamte Zelle mit einer geometrischen Form enthält (Tool-Bar &#8594; &#34; Rechteck, &#34; &#34; Oval, &#34; oder &#34; Polygon &#34;) und fahren Sie mit den Schritten 4.2.3-4.2.5, einen Wert, der am Gesamtsignal zu erhalten. Berechnen Sie das Verhältnis des Signals innerhalb des ausgewählten Bereichs über das gesamte Signal Prozent des Signals im Bereich von Interesse zu erhalten.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritte 4.2.2-4.2.6, die Quantifizierung des Zellvolumens für jede Z-Ebene zu erhalten. Die geometrische Form anpassen, je nach Bedarf.</li>
		<li>Kopieren/Einfügen der Daten aus der &#34; Ergebnisse &#34; Windows für jeden Z-Ebene Layer in eine Tabellenkalkulation für die grafische Darstellung und einen Mittelwert zu finden.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Jüngsten technologischen Fortschritte haben für ein besseres Verständnis der Mechanismen translationale Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs in biologischen Prozessen, wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung zulässig. Die kostengünstige Methodik, die hier beschriebenen lässt die Übersetzung Ereignisse in Zellen zu studieren, wie RNA-bindende Proteine regulieren metastatische Prozesse, wie z. B. zelluläre Adhäsion, Migration und Invasion visualisiert werden.
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Die Regulierung der Übersetzung durch verschiedene Zellfunktionen veranlasste viele Forschungsgruppen zu entwickeln, neue Werkzeuge und Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von mRNA Übersetzung und regulierte Protein Synthese1,2 ,3,4. Diese jüngsten technologischen Fortschritte ermöglichen ein besseres Verständnis der Mechanismen, bei denen Übersetzung Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs bei biologischen Prozessen wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung5 ,6,7,8. Die meisten dieser Methoden erfordern jedoch teuer oder gefährlichen Reagenzien und spezielle Ausrüstung, die möglicherweise nicht die meisten Laboratorien zur Verfügung. Als solche wurde eine kostengünstige Methode ermöglicht die schnelle Beurteilung der Übersetzung Veranstaltungen entwickelt, um speziell diese potenzielle Probleme zu umgehen. Diese Methode erkennt akute translationale Modulationen, die auftreten, während spezifische zelluläre Prozesse und ermöglicht auch für die Lokalisierung der Übersetzung mit der konfokalen Mikroskopie.
Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um lokalisierte Übersetzung innerhalb subzelluläre Kompartimente genannt Verbreitung Einleitung-Center (SIC)5zu überwachen. SICs sind vorübergehende Strukturen gefunden in gesetzte Zellen, die auf der Oberseite entstehende Haftung komplexe lokalisiert sind. Obwohl SICs und Adhäsion komplexe unterscheiden, sind ihre Schicksale eng verbunden. In der Tat SICs bekannt, um auf komplexe fokale Adhäsion Reifung zu einem Haftung während der Anfangsphase der Adhäsion allmählich. Wir fanden, dass RNA-bindende Proteine bekannt, um mRNA Übersetzung (z. B. Sam68, FMRP und G3BP1) gezielt zu steuern und Polyadenylated RNAs, innerhalb dieser angereichert wurden Strukturen5. Mit den beschriebenen Methoden hier, haben wir gezeigt, dass die Regulierung der SIC-assoziierte mRNA Übersetzung wirkt als ein Checkpoint erlaubt Zellen zur Konsolidierung der Zelladhäsion gesät. Diese Methode, basierend auf Puromycin Aufnahme konnte eine angepasste Version der Oberfläche Sensing Übersetzung Assay (Sonnenuntergang) betrachtet werden. Ursprünglich entwickelt, um globale Protein Synthese mit einem nicht radioaktiv markierte Aminosäure messen, bietet Protein Puromycilation eine effiziente Möglichkeit, de Novo Protein Synthese9zu visualisieren. Diese Methode beruht auf das innere Verhalten von Puromycin, ein Antibiotikum, das Übersetzung durch vorzeitigen Kettenabbruch in den Ribosom10blockiert. In der Tat ist Puromycin strukturell analog zu Tyrosyl-tRNA, wodurch für den Einbau in Peptidketten über die Bildung einer Peptidbindung verlängern. Puromycin Bindung an eine wachsende Peptid-Kette verhindert jedoch eine neue Peptidbindung gebildet wird mit der nächsten Aminoacyl-tRNA, da Puromycin eine nicht wasserlöslicher Amid-Bindung anstelle der wasserlöslicher Esterbindung in tRNAs gefunden hat. So entsteht die Einbeziehung von Puromycin in Polypeptide verlängern in der vorzeitigen Veröffentlichung von zahlreichen abgeschnittene Puromycilated Polypeptide entsprechend aktiv übersetzten mRNA9,11,12 .
Mit dieser Methode war es möglich, innerhalb kurzer Zeit Witwe aktive Übersetzung bewerten (z. B. 5 min.) während zellulare Adhäsion über einen spezifischen Antikörper gegen Puromycin auf Zellen, die über einen Zeitraum von 5 Minuten mit dem Antibiotikum ergänzt wurden verarbeiten Sie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Zelladhäsion5. Die Genauigkeit dieser Assay stützt sich auf hochspezifische Antikörper gegen die Puromycilated glyko-gerichtet. Immunofluorescent Erkennung des Polypeptids Puromycilated bietet eine allgemeine subzelluläre Verteilung der neu übersetzten mRNA, die auch mit großer Genauigkeit mit konfokale bildgebenden Systemen quantifiziert werden kann.
Daher bietet diese Methode eine entsprechende Option für eine große Anzahl von Laboren Studium translationale Regulationsmechanismen in Prozesse wie neuronale Granulation6,13,14, 15, Morphogen mRNA Lokalisierung und Übersetzung während der Entwicklung16,17. Es eignet sich auch gut zum Studium lokalisierte oder unterteilte Übersetzung während der schnellen biologischen Ereignisse, wie Zellwanderung, Haftung oder Invasion oder einfach beurteilen medikamentöse Behandlungen, die translational Änderungen5, induzieren könnte 7 , 18. insgesamt ermöglicht diese Methode zur Visualisierung von lokalisierten oder kontrollierte Übersetzung Ereignisse auf eine schnelle, genaue und kostengünstige Weise.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin Antikörper 12D10</td><td>EMD Millipore</td><td>MABE343</td><td>Western Blot Verdünnung 1:25.000 Immunfluoreszenzverdünnung 1:10.000</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG, HRP-linked Antikörperzellsignalisierung</td><td> Technologie</td><td>7076</td><td>Western Blot Verdünnung 1:8.000</td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>4408</td><td>Immunfluoreszenz Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>CF568 Phalloidin</td><td>Biotium</td><td>00044</td><td>Immunfluoreszenz Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Cyclohexmid</td><td>Sigma</td><td>C1988-1G</td><td>50&Mikro; g/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Endkonzentration 1&micro; g/ml</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>bio-Basic</td><td>PJ593</td><td>2.5&micro; g/ml bis 10&micro; g/ml</td></tr><tr><td>Ibidi & micro;-Schale 35 mm, hoch, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 Zellen</td><td>von Dr. Mazroui (Universit&eacute; Laval)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fv1000</td><td>konfokales Bildgebungssystem</td><td>von Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi Software</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td><td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37% Lösung</td><td>bio-Basic</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>bio-Basic</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunfluoreszenz maßnahme global lokalisierte Übersetzung

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Die Mechanismen zur Regulierung der mRNA Übersetzung sind in verschiedenen biologischen Prozessen, wie z. B. Entwicklung von Keim, Zelldifferenzierung und Organogenese, sowie mehrere Krankheiten beteiligt. Zahlreiche Publikationen haben überzeugend gezeigt, dass spezifische Mechanismen eng mRNA Übersetzung regulieren. Verstärktes Interesse an der Übersetzung-induzierte Verordnung der Proteinexpression führte zur Entwicklung neuer Methoden zu studieren und de Novo Protein Synthese in Cellulofolgen. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex, so dass sie kostspielig und häufig Begrenzung der Anzahl der mRNA-Ziele, die studiert werden kann. Dieses Manuskript schlägt eine Methode, die erfordert nur grundlegende Reagenzien und konfokale Fluoreszenz-imaging-System zu messen und zu visualisieren, die Änderungen in der Übersetzung der mRNA, die in jede Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen auftreten. Diese Methode wurde vor kurzem zur lokalisierte Übersetzung in die subzellulären Strukturen der adhärenten Zellen über einen kurzen Zeitraum hinweg, bietet somit die Möglichkeit der Visualisierung de Novo Übersetzung für eine kurze Zeit während einer Vielzahl von biologischen zeigen Prozesse oder Änderungen in translational Aktivität in Reaktion auf bestimmte Reize zu validieren.

Um Übersetzung Ereignisse mithilfe von Puromycin Aufnahme genau zu beobachten, ist es wichtig, die optimale Bedingungen für jede Zelllinie zu bestimmen, da jeder unterschiedliche Puromycin Einbeziehung Kinetik (Abbildung 1)9,11 zeigt ,12,18. Daher um Puromycin Aufnahme zu überprüfen, ist es notwendig, die gewünschte Zell-Linie mit ...

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, kompartimentalisierte Translationserignisse sichtbar zu machen und zu quantifizieren, die während der Anfangsphasen der Zelladhäsion stattfinden. Diese Methode hat eine breite Anwendung. Wenden Sie sie immer dann an, wenn eine schnelle, spezifische Translationsantwort untersucht werden soll, beispielsweise bei der Analyse von Zellmigration, Adhäsion oder frühen Arzneimittelwirkungen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach, schnell und kostengünstig ist. Es werden lediglich Puromycin, Antikörper gegen Puromycin und ein standardmäßiges konfokales Scanning-Imaging-System benötigt. Zunächst wird eine Suspension von MRC-5-Zellen hergestellt.Verwenden Sie die Trypsinisierung, gefolgt von einer Zentrifugation, Entfernung des Überstandes und anschließender Resuspension in DMEM mit zehn Prozent FBS bei 40.000 Zellen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Suspension unter leichtem Rühren für 20 Minuten, um die fokalen Adhäsionskomplexe vollständig zu lösen. Dies ist entscheidend.Als Nächstes zwei Aliquote der Suspension je in zwei 35-Millimeter-Glasboden-Schalen geben und inkubieren, um die zelluläre Adhäsion und SiC-

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung des transportierten infizierten Zellproteins 0, ICP0 bei einer Herpes-simplex-Virus-1-Infektion. Nach der De-novo-Synthese transloziert ICP0 in den Zellkern und wandert später während des Fortschreitens der Infektion in das Zytoplasma. Die Immunfluoreszenzmikroskopie enthüllt und analysiert die subzelluläre Lokalisation des Proteins und bietet Einblicke in seinen Transport über Infektionsphasen hinweg.

Eine Immunfluoreszenztechnik zur Lokalisierung viraler Proteine in infizierten Zellen

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Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Hier wird ein neuartiger quantitativer Fluoreszenzassay entwickelt, um Änderungen des Spiegels eines Proteins spezifisch an Zentrosomen zu messen, indem die Fluoreszenzintensität dieses Proteins auf die eines geeigneten internen Standards normalisiert wird.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Die präzise Lokalisierung der Golgi-Bewohner ist wesentlich für das Verständnis der zellulären Funktionen der Golgi. Konventionelle Lichtmikroskopie ist jedoch nicht in der Lage, die Sub-Golgi-Struktur zu lösen. Hier beschreiben wir das Protokoll für eine konventionellen Mikroskopie basierte Höchstauflösung Methode, um die Sub-Golgi Lokalisation eines Proteins quantitativ zu bestimmen.

Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse

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Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

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Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Lernen Sie eine quantitative Immunfluoreszenzmethode zur Visualisierung lokalisierter Translation in MRC-5-Zellen während der Zelladhäsion. Diese kostengünstige Technik ermöglicht schnelle Analysen mit Standard-Konfokalmikroskopie.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

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