Multimer-PAGE zur Trennung nativer Proteinkomplexe: eine hybride Trenntechnik bestehend aus blauem native-PAGE und SDS-PAGE zur Trennung intakter multimerer Proteine aus Gewebelysat

Multimere Proteinkomplexe sind essentiell für verschiedene biologische Prozesse.

Um Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand durch Multimer-PAGE zu trennen, wird Gewebelysat entnehmen, das die gewünschten Komplexe enthält. Laden Sie das Lysat auf eine Gel-Assemblierung für die native Blue-PAGE.

Füllen Sie das System mit einem alkalischen Laufpuffer mit blauem anionischem Farbstoff und schließen Sie ihn an die Stromversorgung an. Bei einem alkalischen pH-Wert binden Farbstoffmoleküle an den Proteinkomplex und verleihen ihm eine insgesamt negative Ladung, ohne zu denaturieren. Dieser negativ geladene, intakte Proteinkomplex wandert als blaue Bande durch das Gel.

Nach einem minimalen Lauf und dem Einweichen des intakten Proteins in das auflösende Gel wird der Streifen, der den Komplex enthält, herausgeschnitten. Inkubieren Sie den Streifen in einer Lösung, die ein Vernetzungsmittel enthält, damit seine reaktiven Gruppen mit den Amingruppen des proximalen Proteins interagieren und den multimeren Komplex stabilisieren können.

Ersetzen Sie die Vernetzungslösung durch ein Quenching-Reagenz, um die Aktivität der nicht umgesetzten Vernetzer zu verringern. Fügen Sie SDS hinzu - ein anionisches Detergens -, das dem intakten Proteinkomplex eine gleichmäßige negative Ladung verleiht, während seine native Größe und Zusammensetzung erhalten bleiben.

Legen Sie den behandelten Streifen in eine frische Kassette und gießen Sie ihn erneut in ein neues SDS-PAGE-Gel. Bei der Elektrophorese wandert der negativ geladene vernetzte Proteinkomplex in Richtung der positiven Anode und erscheint als hochmolekulare Bande im Gel.