Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Strategie ist es, die unterschiedlichen funktionellen Anordnungen aufzuklären, an denen ein Protein beteiligt sein kann, und zwar durch die Fraktionierung von affinitätsgereinigten Proteinkomplexen und die massenspektrometrische Korrelationsprofilierung. Diese Methode kann dazu beitragen, den Proteinlisten, die durch massive Spektrometrie-Experimente zur Affinitätsreinigung erstellt wurden, organisatorische Informationen hinzuzufügen. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind, dass es einfach durchzuführen ist, eine gute Auflösung hat und wenig mehr Arbeit erfordert als herkömmliches Gel-CMSMS.

Dieses Protokoll ist optimiert für die Aufreinigung von Proteinkomplexen aus 200 bis 500 Millionen Zellen, die endogene Spiegel eines FLAG-markierten Proteins exprimieren. Nach dem Auftauen des Zellpellets, wie im Textprotokoll beschrieben, werden fünf Milliliter eiskalter Lysepuffer, der DTT und Proteaseinhibitoren enthält, in die Zellsuspension gegeben und zum Mischen geschwenkt. Inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang auf Eis.

Übertragen Sie die Zellsuspension in einen Cold-Down-Homogenisator. Die Zellen werden mit 20 bis 30 Hüben mit dem festen Stößel lysiert, bis keine spürbare Viskosität mehr vorhanden ist, und dann das Homogenat in kalte Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen wird das gereinigte Lysat in ein sauberes kaltes Röhrchen überführt, wobei etwa 50 Mikroliter Lysat zurückbleiben.

Speichern Sie ein Aliquot von 35 Mikrolitern Lysat, um die Proteinkonzentration zu messen und die Reinigung zu überwachen. Entfernen Sie anschließend den Puffer von den zuvor vorbereiteten Kügelchen. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit einem Milliliter des Lysats und mischen Sie es dann mit dem Rest des Lysats.

Inkubieren Sie die Mischung auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Stunden. Sammeln Sie die Perlen an der Seite der Tube mit einem Magneten. Sammeln Sie ein Aliquot von 30 Mikrolitern Überstand und entsorgen Sie den Rest.

Resuspendieren Sie die Kügelchen in 0,5 Millilitern IPP150-Puffer, indem Sie vier- bis sechsmal pipettieren. Übertragen Sie dann die Suspension in einen 1,5-Milliliter-Kaltschlauch. Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal mit 0,5 Millilitern nativem FLAG-Elutionspuffer.

Übertragen Sie die Kügelchen nach dem letzten Waschen in einen neuen kalten Schlauch. Entfernen Sie den Puffer gründlich. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern von 200 Mikrogramm pro Milliliter 3X5-Peptid in nativem Elutionspuffer.

Dann 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit sanfter Drehung inkubieren. Sammeln Sie die Kügelchen mit dem Magneten und übertragen Sie den Überstand in eine kalte neue Röhre. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, bevor Sie alle Eluate ziehen.

Das Eluat wird in einer Zentrifugalfiltereinheit durch Zentrifugation bei 10.000 G bei vier Grad Celsius auf bis zu 25 Mikroliter konzentriert. Bereiten Sie die Probe vor, indem Sie dem konzentrierten 25-Mikroliter-Eluat 4x nativen Probenladepuffer und 0,5 % G-250 Probenadditiv hinzufügen. Laden Sie die Probe und die nativen Molekulargewichtsmarker und lassen Sie eine leere Vertiefung dazwischen.

Laden Sie dann 10 bis 20 Mikroliter 1X nativen Probenladepuffer in alle leeren Vertiefungen. Füllen Sie die Kathodenkammer vorsichtig mit 200 Millilitern 1X nativem dunkelblauem PAGE-Kathodenpuffer, um die Proben nicht zu stören. Füllen Sie die Anodenkammer mit 550 Millilitern 1X nativem PAGE-Anodenpuffer.

Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 150 Volt laufen. Entfernen Sie nach dem Stoppen des Laufs den dunkelblauen Kathodenpuffer mit einer serologischen Pipette und ersetzen Sie ihn durch 1X hellblauen Kathodenpuffer. Nachdem Sie den Lauf 60 Minuten lang fortgesetzt haben, öffnen Sie die Gelkassette und entsorgen Sie eine der Kassettenplatten.

Das Gel bleibt an der anderen Kassettenplatte haften. Legen Sie das Gel in eine Schale, die genügend Fixierlösung enthält, um es zu bedecken, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie dann die Fixierlösung und ersetzen Sie sie durch Wasser, bevor Sie das Gel scannen.

Zur Vorbereitung der Massenspektrometrie legen Sie zunächst eine konische untere 96-Well-Platte auf eine andere 96-Well-Platte, um den Abfall aufzufangen. Durchstechen Sie den Boden der Vertiefungen der konischen 96-Well-Platte mit einer 21-Gauge-Nadel. Geben Sie dann 200 Mikroliter 50 % Acetonitril, 0,25 % Ameisensäure in die Vertiefungen der durchstochenen Platte.

Inkubieren Sie den Plattenstapel 10 Minuten lang in einem Shaker. Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte eine Minute lang bei 500 mal G, so dass die Flüssigkeit durch die Löcher in die Abfallauffangplatte fließt. Nachdem Sie die Waschschritte zweimal wiederholt haben, füllen Sie die Vertiefungen der durchstochenen 96-Well-Platte mit 150 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat.

Geben Sie anschließend das Gel auf eine saubere Oberfläche. Schneiden Sie die Lane mit der Probe in 48 identische Scheiben. Schneide jede Scheibe in zwei oder drei kleinere Stücke, mit Ausnahme der letzten fünf Scheiben oben auf dem Gel.

Legen Sie jede Scheibe nacheinander in eine Vertiefung der durchstochenen 96-Well-Platte. Geben Sie 50 Mikroliter Acetonitril in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte unter Schütteln für 30 bis 60 Minuten. Nachdem Sie die Flüssigkeit durch Zentrifugation entfernt haben, geben Sie 200 Mikroliter zwei Millimeter TSEB und 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat in jede Vertiefung

Die Platte wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt, bevor die Flüssigkeit wie zuvor durch Zentrifugieren entfernt wird. Dehydrieren Sie die Gelstücke, indem Sie 200 Mikroliter reines Acetonitril hinzufügen und unter Schütteln bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubieren, bis die Gelstücke weiß und undurchsichtig sind. Nachdem Sie das Acetonitril entfernt haben, geben Sie 150 Mikroliter Trypsin in kaltem Ammoniumbicarbonat in jede Vertiefung

Inkubieren Sie die Platte unter Schütteln bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Legen Sie anschließend eine saubere konische Bodenplatte unter die gelhaltige Platte, um die korrekte Ausrichtung der Platten zu gewährleisten. Sammeln Sie dann die Flüssigkeit, die die Peptide enthält, durch Zentrifugation bei 200-fachem G für eine Minute.

Legen Sie die peptidhaltige Platte in einen Zentrifugalverdampfer und verdampfen Sie die Flüssigkeit, während Sie den nächsten Schritt durchführen. Geben Sie 150 Mikroliter 50% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure zu den Gelstücken. Inkubieren Sie unter Schütteln bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.

Die Flüssigkeit wird durch Zentrifugation bei 200 mal G für eine Minute in der teilweise getrockneten Platte gesammelt. Fahren Sie mit dem Verdampfen der peptidhaltigen Platte fort, während Sie den nächsten Schritt ausführen. Übertragen Sie die Peptidlösungen auf die gewaschene Zentrifugalfiltrationsplatte.

Legen Sie eine saubere konische Bodenplatte darunter, um die Peptide zu sammeln, und zentrifugieren Sie den Plattenstapel wie zuvor. Verdampfen Sie die Flüssigkeit in der konischen Bodenplatte, bis die Vertiefungen vollständig getrocknet sind. Nach dem Trocknen kann die Platte mit einem Silikondeckel abgedeckt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bis Massenspektrometrie und Datenanalyse durchgeführt werden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Repräsentative Ergebnisse aus der hierarchischen Clusterung von blauen nativen PAGE-Migrationsprofilen von Mta2 und coreinigenden Proteinen sind hier als Dendrogramm und Heatmap dargestellt, die die Proteinintensitäten darstellen. Das Migrationsprofil von Mta2 zeigt zwei Peaks, die auf zwei unterschiedliche Komplexe hinweisen. Einige NuRD-Untereinheiten zeigen ein ähnliches Muster mit der höchsten Häufigkeit in der Assemblierung mit niedrigerem Molekulargewicht.

Im Gegensatz dazu sind andere NuRD-Untereinheiten in der NuRD-Assemblierung mit höherem Molekulargewicht häufiger vorhanden. Auf der anderen Seite ist der Mta2-Interaktor Cdk2ap1 nur in der NuRD-Assemblierung mit höherem Molekulargewicht vorhanden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb Tagen durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben und Reagenzien auf Eis zu legen, um eine Dissoziation von Proteinkomplexen zu vermeiden. Dieses Verfahren kann auf jedes Protein von Interesse angewendet werden, vorausgesetzt, es kann aus dem Affinitätsmedium durch kompetitive Elution unter nativen Bedingungen betrachtet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die umgekehrte oder sequentielle Co-Immunpräzipitation durchgeführt werden, um die identifizierten Subkomplexe zu validieren.